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目前,由于人们生活环境受到污染严重,生活精神压力较大,恶性肿瘤成为损害人类健康的重大疾病之一。目前,以化疗为主来治疗恶性肿瘤,抑制其生长增殖是疗效较好的方法。在众多的化疗药物中,最初来源于植物的抗肿瘤药占有较大的比例,而且其抗肿瘤活性较为显著。但是仅有小部分来源于植物的抗肿瘤药物做了生物活性筛选和药理作用研究。因此,我们根据肿瘤发生、发展的机制,筛选出升麻中提取分离的化合物,并对具有抗肿瘤活性的化合物,进一步研究其作用机制。我们首先选用转染了突变p53和ras的小鼠细胞(p53-/-+v+Ras和p53-/-+s+Ras)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),采用MTT进行抗肿瘤活性筛选,结果显示升麻中环阿尔廷烷型四环三萜化合物KY17具有显著的抗肿瘤活性,对小鼠细胞的IC50分别为13.1μM和13.94μM。后来发现KY17对结肠癌细胞系(HCT116、HT-29、SW480)具有选择性活性,其 IC50 值为 HCT116、HT-29、SW480 的 IC50分别为9.31±0.98μM、8.84±1.1μM和8.75μM。细胞周期分析发现,KY17可以使HT-29细胞周期阻滞在G2/M期。Western blotting分析发现10μM的KY17处理HT-29细胞可以导致凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3、Caspase-8的切割。用AnnexinV/PI双染法,发现KY17呈浓度依赖和时间依赖性诱导HT-29细胞凋亡。有趣的是实验中发现KY17处理细胞后会产生空泡,通过GFP-LC3蛋白融合示踪法、吖啶橙染色法等方法分析,发现1μM KY17就能诱导HT-29细胞自噬。利用自噬抑制剂Bafilomycin A1联合KY17处理HT-29,分析发现细胞凋亡加强。这也提示KY17诱导HT-29细胞自噬作用保护细胞凋亡。KY17并不会诱导HT-29细胞产生活性氧。此外,我们还对KY17对衰老相关因子的调节情况进行初步探索发现,KY17会使HCT116细胞miRNA-34a上调、SIRT1抑制,从而激活p53。综上所述,本课题的研究发现,升麻中分离的KY17化合物通过诱导HT-29周期阻滞抑制增殖和细胞凋亡,同时还会诱导HT-29细胞自噬,且此自噬保护细胞减少凋亡。替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是新型的口服第二代烷化剂,属于咪唑四嗪类衍生物抗肿瘤药物。TMZ在生理PH条件下,不需经过肝脏P450酶代谢即可自动水解开环,转化为中间产物5-(3-甲基三氮烯-1-)咪唑-4-酰胺(MTIC),其抗肿瘤活性源于其进一步水解为5-胺基咪唑-4-甲酰胺(AIC)和具有高度抗肿瘤活性的阳离子甲基肼。甲基肼就是烷基化DNA(甲基化)的活性片段,它主要烷化鸟嘌呤的O-6和N-7位,形成5%O-6meG,75%meG。TMZ的抗肿瘤活性主要通过DNA鸟嘌呤6位氧的甲基化,即06-甲基鸟嘌呤(06-methylguanine,06-meG)介导发挥。06-meG在DNA复制中碱基错配,导致子链DNA有缺口形成,造成其单链或双链的断裂,最终阻碍DNA复制,抑制肿瘤生长。然而,细胞内的DNA修复酶06-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(06-methylguanine-DNAmethyltransferase,MGMT)可以催化鸟嘌呤 06 位上的甲基转移至自身蛋白第145位半胱氨酸残基上,不可逆地修复TMZ烷化DNA产生06-甲基鸟嘌呤,导致其抗肿瘤活性降低,产生耐药。因此,TMZ的耐药性限制了其在临床上的应用。为了避免TMZ对肿瘤细胞的耐药性,Malcolm Stevens教授的研究团队修饰TMZ的结构,合成了 TMZ的衍生物377等一系列的化合物。抗肿瘤活性筛选结果表明377具有广谱的抗癌活性。但是目前的研究还未揭示377与DNA的作用和形成加合物的特点。因此本次研究目的旨在探讨TMZ衍生物377与小牛胸腺DNA(ctDNA)的结合位点,形成的DNA加合物种类,进而揭示化合物377较TMZ可以逃避耐药,具有广谱的抗癌活性的原理,为设计和研发不对DNA修复耐药的DNA损伤药物提供理论依据。我们首先采用紫外分光光度计进行全波长扫描,结果显示,经过TMZ、化合物377与小牛胸腺DNA加合反应的样品最大吸收波长变大。这提示TMZ和化合物377与小牛胸腺DNA可能发生了烷化反应。通过高效液相色谱检测出酶解后的小牛胸腺DNA各个碱基和TMZ、化合物377的稳定性及水解产物。进一步采用超高压液相色谱-高分辨质谱,鉴别指认出各个化合物水解组分的分子式。推测出水解产物的结构式发现化合物377在PH=7.4时与TMZ开环方式一样,开环产生活性产物甲基肼,由甲基肼烷化DNA。377化合物水解开环后的中间产物相比TMZ产物的MTIC较稳定。然后采用液相色谱和质谱联用的方法确定377与ctDNA的结合位点较多,并且很容易与DNA发生亲和加成反应,产物包括N3甲基腺嘌呤、N7甲基鸟嘌呤、06甲基鸟嘌呤、N3甲基胸腺嘧啶、N3甲基胞嘧啶脱氧核苷酸、N3甲基腺嘌呤脱氧核苷酸。与TMZ相比,377水解后的中间体较稳定,与DNA的结合位点较多,产生的加合物种类也较多,所以具有更强的抗肿瘤活性。综上所述,本课题的研究发现,生理条件下(PH=7.4的Na+缓冲液),化合物377开环原理与TMZ一样,但是水解开环后的中间产物较稳定。在体外,化合物377与ctDNA会产生多个不同位点的加合产物。