目的：二胺氧化酶(DiamineOxidase，DAO，EC1.4.3.6)属于含铜胺氧化酶，可以氧化组胺和腐胺去氨基，可调节组织中组胺和腐胺的循环水平。人DAO由751个氨基酸组成，在分裂细胞中高度表达。近年来许多研究证实，多胺、二胺氧化酶等酶类在许多癌组织中高度表达，与多种肿瘤的发生和发展有密切关系，如乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌等，因此，可以作为一种新的肿瘤标记酶。DAO在外周血中活性稳定，如在卵巢及子宫恶性肿瘤患者的血液中DAO活性持续升高，而在某些肠道损伤性疾病则活性降低。目前，国内外一些实验室采用比色法和放射学法测定血清中DAO活性来诊断一些疾病，但因方法不稳定造成结果误差或接触同位素等原因，难于在临床上广泛应用。因而，需要建立一种灵敏度高、简便快速、稳定的方法在临床上推广应用。我们首先制备了抗人二胺氧化酶抗体，利用免疫化学法测定了不同肿瘤组织中DAO的表达；建立了二胺氧化酶的酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测了血清中DAO的含量，极大提高反应的灵敏度和特异性，方法简便、稳定，便于临床推广和肿瘤的大面积普查，并提高了早期诊断水平。 方法：1应用GOLDKEY软件从蛋白质数据库中调出人DAO氨基酸序列，对DAO的Hopp&Woods亲水性参数、抗原性参数、可及性参数、β-转角等多参数分别进行预测，然后用万氏及吴氏法进行综合分析其准确性。 2抗DAO抗体的制备 2.1用天然DAO(sigma产品)作为抗原与福氏完全佐剂充分混匀，免疫新西兰兔淋巴结，中间经多次加强免疫，测定其效价。待达到要求效价时颈动脉放血，分离血清，采用沉淀法纯化血清IgG，获得抗DAO多克隆抗体。 2.2应用方法1选取的DAO抗原表位的氨基酸序列，合成多肽抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合后，选出抗DAO抗原表位的阳性克隆，再进行亚克隆，将稳定分泌抗DAO抗原表位单克隆抗体的细胞株进行扩大培养。抗体效价用ELISA法检测。取一定量杂交瘤细胞给BALB/c小鼠腹腔注射，约两周后收集腹水，得到高效价抗DAO抗原表位的IgG，应用SDS-PAGE和Westernblot等方法对抗体进行纯度和特异性鉴定。 3采用免疫组化SP法，用所制备的抗DAO单克隆抗体对不同肿瘤组织及其相应正常组织进行了检测，其中包括：乳腺癌，结直肠癌，子宫内膜癌，胃癌。分析了DAO表达和乳腺和结直肠等组织肿瘤发生及其与临床病理之间的关系。 4以改良过碘酸钠法用HRP对抗DAO-IgG标记后制备酶标抗DAO抗体，建立了DAO的ELISA检测方法，并对方法的灵敏度和特异性进行了系列研究。测定了113例献血员血清中DAO含量，确定了人血清中DAO的正常值。 结果：1通过对DAO氨基酸序列的B细胞表位的多参数预测，所预测的一些抗原表位数目和所处的肽段位置有一些参数结果不同，但在氨基酸序列的543-553和569-595这两个肽段几种预测方法的结果完全一致，且接近β-转角处。因此，我们认为此两处氨基酸片段或其附近可能有抗原表位。根据综合结果最终选取氨基酸残基567-582片断作为DAO的抗原表位，合成了具有4分枝结构的DAO复合肽抗原。2制备的抗DAO多克隆抗体效价为1∶32(双扩法)，单克隆抗体效价为1∶640,000(ELISA)。所有抗体均可与天然DAO发生结合反应。3DAO在乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌和胃癌中都有明显高表达。DAO在乳腺癌和结直肠癌中有很高的阳性率(80％)，且显著高于其良性病变组织(p＜0.01)，并在癌前病变有阳性表达区域。4双抗体夹心ELISA法检测113例献血员血清中DAO含量，其中男性53例，DAO含量(-X±s)为0.27±0.24μg/ml，女性60例，DAO含量(-X±s)为0.45±0.33μg/ml。男女性别之间有显著差异(P＜0.01)。 结论：1根据多参数综合预测，筛选出DAO抗原表位氨基酸片段，以此合成的抗原肽所制备的抗体可与天然抗原反应，具有高度的特异性。2所制备的抗DAO单克隆抗体用于免疫组织化学方法检测，显示出DAO在多种肿瘤组织中呈高表达状态，对恶性肿瘤的诊断和预后判定有一定参考意义。3用抗DAO多克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA法可用于对肠道损伤和某些恶性肿瘤的血清DAO含量测定，可在临床大范围推广。