背景与目的:肺癌是危害身体健康的常见恶性肿瘤之一。靶向治疗成为晚期非小细胞肺癌患者最重要的治疗手段,具有特异性强、不良反应轻的特点,极大地改善了非小细胞肺癌患者的预后,但大部分非小细胞肺癌患者经靶向治疗后都无可避免的出现耐药,导致疾病进展。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)的获得性耐药是非小细胞肺癌靶向治疗的主要挑战。CDK4/6抑制剂PD0332991能特异性抑制CDK4/6的活性及细胞周期进展,在乳腺癌、多发性骨髓瘤等多种恶性肿瘤中疗效显著,与抗肿瘤药物联合应用具有协同作用,能够提升肿瘤细胞对多种抗肿瘤药物的敏感性,增加治疗效果,延缓耐药的发生。本研究目的:1.探索非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药与细胞周期调控异常的关系;2.探索CDK4/6抑制剂PD0332991与奥希替尼联合对奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR的作用;3.探索与第三代EGFR-TKIs奥希替尼的获得性耐药有关的差异基因表达。方法:本研究利用Western blot实验,观察正常支气管上皮细胞株、非小细胞肺癌细胞株、EGFR-TKIs敏感肺癌细胞株以及EGFR-TKIs获得性耐药肺癌细胞株之间在细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6、CyclinD、Rb、P-Rb(S780)、P-Rb(S795)、E2F1蛋白的表达情况;CCK8实验、流式细胞学技术、Transwell实验、EdU细胞增殖实验,探索联合用药对奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移能力、细胞增殖能力的影响;奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR构建动物实验模型,观察联合用药对肿瘤生长的影响;免疫组化染色Ki-67检测肿瘤细胞的增殖情况;高通量测序探索与耐药机制相关的差异基因进行研究。结果:本研究发现EGFR-TKIs敏感肺癌细胞株与EGFR-TKIs获得性耐药肺癌细胞株在CDK4/6-CyclinD-Rb/E2F信号通路存在差异表达,证实了非小细胞肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药与细胞周期调控异常有关;PD0332991联合Osimertinib能增加其对奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR细胞活力的抑制作用,诱导细胞凋亡,导致细胞周期S期阻滞,抑制细胞迁移和增殖能力,并抑制肿瘤生长和肿瘤细胞增殖;用奥希替尼、PD0332991以及联合用药处理H1975AR后,提取RNA,进行RNA-seq,测序结结果显示联合用药处理后差异基因主要富集在细胞黏附通路,其中多功能蛋白聚糖基因(Versican,VCAN)差异最为显著。利用siRNA干扰技术、CCK8实验、Transwell实验、EdU增殖实验,发现敲低VCAN后奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR对奥希替尼的敏感性增高,细胞迁移能力下降,显著抑制细胞增殖能力,提示第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂奥希替尼的获得性耐药可能与多功能蛋白聚糖基因表达异常有关。