2012年,全球有超过800万人死于癌症,我国每天就有8550人成为癌症患者。毫无疑问,癌症在当前社会已经成为人类健康的头号杀手。癌症致死的最主要原因是肿瘤的扩散和远处转移(micrometastasis),常规的检测手段却很难及时发现。近年来循环肿瘤细胞吸引了人们极大的关注,被视为癌症研究的biomarker。循环肿瘤细胞(CTC)是指那些从肿瘤组织上脱落下来并进入血液全身循环的癌细胞。它是由普通癌细胞转化而来,并且随时可以通过逆分化再次长出肿瘤组织,因此它与癌症的扩散和转移密切相关,是反映癌症病情发展的风向标,对其进行详尽研究对于癌症的早期诊断与治疗具有决定性的意义。本论文以血液中的循环肿瘤细胞作为研究主体,开展了三个方面的研究工作：一是开发了基于硝酸纤维素膜的CTC捕获芯片。人体外周血液中CTC的含量很低,一般不会超过100个/mL,而血液中的红细胞白细胞等背景干扰细胞则高达109个,这要求我们必须开发相应高选择性和高效率的捕获手段将其从血液中分离出来。二是创新性应用大规模表面增强拉曼光谱(SERS)成像技术对捕获到的CTC进行高灵敏的计数。我们开发了新型的拉曼探针,以确保SERS成像的高灵敏度。三是开发了一系列蛋白质组学研究的新技术。在蛋白质组学飞速发展的今天,我们从血液中分离捕集到的癌细胞,最好能够进行详尽的蛋白质组学研究,以期从分子层面更深入了解癌症的发生发展机理,因而我们开发了蛋白质高效富集和快速酶解的相关技术。基于上述研究思路,本论文主要分为五章进行：第一章是文献综述。主要介绍了循环肿瘤细胞的起源和生物学意义,对当前癌症诊断和治疗的重大作用；血液中CTC高选择性捕集技术的发展历程和当前最新进展；SERS成像技术自身的巨大优势和在癌细胞成像上的应用前景；当前低浓度蛋白质组学研究的现状和亟需解决的技术难题。最后引出本论文的研究目的和意义：开发出针对血液中循环肿瘤细胞的捕集、检测和后续蛋白质组学研究的新方法新技术,以期对癌症的诊断和治疗提供更多的理论支持。第二章是基于硝酸纤维素膜的芯片对血液中的循环肿瘤细胞的高效捕获。硝酸纤维素膜便宜易得,生物亲和性好,更为重要的是它对蛋白质有天然的亲和吸附能力,可以用来自组装固定抗体,制备出高效便捷的CTC捕集膜基底。我们采用EpCAM CD326抗体和非小肺癌细胞NCI-H1650癌细胞作为目标验证了其捕获性能,超过70%的癌细胞能够被成功捕获；在模拟加入了100个目标癌细胞的1mL人全血中,仍然成功分离检测出来34个细胞。为了进一步解决膜基底上癌细胞吸附不牢靠,洗脱损失严重的问题,我们以硝酸纤维素膜为主体构建了微流体芯片。芯片孔道长20 mm,宽4mm,中间还有一些微柱阵列。通过对抗体吸附前后的溶液进行SDS-PAGE分析,可以计算得知抗体的吸附量。另外还考察了不同流速条件下癌细胞的捕获效率,在最优条件0.3 μL/min的流速下,接近70%的癌细胞能够被成功捕集。在100个癌细胞/mL的人全血分析测试中,45%的模拟细胞也能够被检测,证明了此种芯片在人全血中CTC分离检测的光明应用前景。第三章是大范围SERS成像用于CTC的高灵敏性检测与计数。相比于传统的荧光成像,SERS技术具有探针分子稳定、背景干扰小、特征拉曼峰较窄因而可以同时进行多重标记检测以及提供分子内价键信息等一系列优点,为此我们开发了具有三明治结构的高灵敏性SERS探针。以60nnm金球为核心,在其表面修饰上双功能分子pMBA,一方面作为拉曼特征信号分子,另一方面让其羧基与抗体的氨基反应,作为抗体连接分子。这样拉曼探针的设计更加简便,同时SERS探针的信号强度更高。我们用制备好的探针分子标记癌细胞,其特异性非常好,超过99%的目标癌细胞能成功标记,而阴性对照细胞则不显示拉曼特征峰。用CTC芯片捕获到的癌细胞,经SERS标记后再进行大范围拉曼扫描,通过软件模拟即可得相对应的SERS成像图。成像精度非常高,可替代传统的荧光扫描成像。第四章是磁性石墨烯复合材料对低丰度蛋白的富集。目前在少量细胞的蛋白质组学研究中,对低丰度蛋白进行富集以提高其浓度进行后续质谱分析非常关键。石墨烯材料作为吸附基底,主要是基于π电子相互作用、疏水相互作用以及静电相互作用,目前广泛应用于有机污染物、金属离子、DNA和肽段等富集应用中。但是蛋白质空间结构复杂,亲疏水性和带电性差异很大,因而需要高效的富集材料。我们开发了具有核-壳结构的石墨烯复合材料,四氧化三铁为核心,可以在外加磁场的条件下实现高效的分离；外面的石墨烯壳层包覆延伸,因而具有很大的比表面积,这就保证了蛋白质富集的负载量和富集效率。按照石墨烯包覆方式的不同,我们分别设计了两种磁性石墨烯材料。一种是在200 nmFe3O4磁球外面包一层二氧化硅,然后用硅烷化试剂APTES修饰上胺基,再在EDC和NHS的作用下让胺基与氧化石墨烯的羧基发生反应连接起来,最后用水合肼还原氧化石墨烯；另一种是在200nm磁球外面包裹上一层壳聚糖,让磁球带强的正电,再与带负电的氧化石墨烯通过静电作用结合起来。这两种材料都具有石墨烯包覆容量高、比表面积大、水溶性好的优点。在对Cyt-c等标准蛋白的富集中,富集效果都非常好,相对应的负载量分别达到了0.117mg/g和0.247mg/g。在结合靶上激光辅助酶解等技术后,对Cyt-c的最低检测限达到了10ng/mL。在人血清蛋白质组学研究中,用石墨烯材料富集代替商用的C18富集小柱,一个一维馏分的蛋白检测量从39个显著上升到了123个,证明了其未来在低浓度蛋白质富集上的应用前景。第五章是激光辅助的固定酶反应器用于蛋白质快速高效酶解。在当前蛋白质组学研究中,蛋白质一般要先酶解成肽段然后再质谱分析肽指纹谱。目前传统的水溶液酶解存在酶解时间长、效率低以及难以实现在线联用的缺点。我们开发了以聚丙烯酰胺为基底,原位聚合固定胰酶(trypsin)的酶解整体柱。其具有很好的亲水性和通透性,而且原位聚合导致trypsm的固定量很高,标准蛋白Myo、BSA、Cyt-c均可以在5 mmin内达到非常理想的酶解效果,这一技术也成功在人肝蛋白质组学研究中得到了应用。为了进一步提高酶解效率,我们使用808 nm近红外激光照射来辅助整体柱的蛋白质酶解。这样蛋白质溶液以0.5μL/min的流速流过整体柱,就能取得理想的酶解效果,真正做到了流过即酶解,满足了和色谱质谱在线联用的要求。综上所述,本论文紧紧围绕血液中的循环肿瘤细胞这一研究目标,开发了硝酸纤维素膜芯片对其的高效捕获、大范围SERS成像对其高灵敏性的检测、磁性石墨烯复合材料用于细胞低丰度蛋白的高效富集以及激光辅助的固定酶反应器用于蛋白质快速酶解等一系列技术,对当前CTC的研究具有巨大的推动作用。也期待今后的研究能够利用这些技术,更加透彻地了解CTC与癌症诊断治疗的关系,为全人类的健康造福。