MBL对白假丝酵母菌感染鼠体内Treg/Th17细胞免疫平衡的调节作用

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背景甘露聚糖结合凝集素(Mannose-binding lectin,MBL)是固有免疫系统补体激活途径的关键分子;近年来研究发现MBL在获得性免疫应答中也发挥着不可或缺的作用。在感染情况下,机体CD4+T细胞群在获得性免疫调节中发挥着重要作用,尤其是Treg/Th17细胞免疫轴的动态变化,影响了炎症反应的发生、发展以及转归。白假丝酵母菌是一种机会性致病真菌,通常会在人类胃肠道、皮肤、腔道粘膜定植,在一定条件下可以引起致命的侵袭性真菌感染,具有高致病性和致死率。因此,深入研究机体在白假丝酵母菌感染时,MBL对Treg/Th17细胞免疫平衡的调节,对阐明MBL在获得性免疫方面的作用,具有重要意义。目的研究甘露聚糖结合凝集素(Mannose-binding lectin,MBL)对白假丝酵母菌感染鼠体内Treg、Th17细胞分化的调节及相关机制。方法1.白假丝酵母菌培养及CFU菌落计数:沙保罗真菌培养基和YPD固体培养基培养白假丝酵母菌,CFU菌落计数法进行菌落计数。2.白假丝酵母菌腹腔注射感染小鼠:MBL-/-C57BL/6和WT C57BL/6小鼠分四组,2×10~7CFU白假丝酵母菌(C.albicans)对感染组小鼠腹腔注射。3.石蜡切片:感染3天后取小鼠肝脏和肾脏病理切片,H&E染色和PAS染色观察小鼠病理组织学变化。4.流式细胞术(FACS)检测:7天后摘除小鼠眼球取静脉血,流式细胞术分析小鼠体内Treg和Th17细胞。5.实时荧光定量逆转录PCR(q RT-PCR):颈椎脱臼处死小鼠后取脾脏细胞,MACS磁性分选获得CD4+T细胞,提取总RNA,检测其体内Foxp3、RORγt m RNA的表达。6.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测:从不同组小鼠中取静脉抗凝血,ELISA法测小鼠体内细胞因子IL-10和IL-17A的含量。7.蛋白免疫印迹实验(Western blotting):取小鼠脾脏CD4+T细胞,提取总蛋白,Western blotting检测Foxp3、RORγt、SOCS3蛋白表达水平;检测JAK/STAT通路相关蛋白质分子磷酸化的情况。结果1.成功建立C.albicans感染鼠模型。2.和WT感染组相比较:流式分析显示MBL-/-感染组小鼠体内Th17细胞亚型数目比例增高,Treg细胞亚型数目比例降低。3.和WT感染组相比较:q RT-PCR结果显示MBL-/-感染组小鼠体内转录因子RORγt m RNA表达升高,转录因子Foxp3 m RNA表达降低。4.和WT感染组相比较:ELISA结果显示MBL-/-感染组小鼠体内IL-17A水平明显增高,IL-10水平降低。5.和WT感染组相比较:Western印迹结果表明,MBL-/-感染鼠P-STAT3(Y705)、P-JAK2(Y1007+Y1008)蛋白表达增加,下游RORγt表达增强,SOCS3表达减弱,P-STAT5(Y694)蛋白表达水平减弱,STAT5上游蛋白JAK3(Tyr980/981)位点的磷酸化水平减弱,下游Foxp3表达减弱。结论在小鼠腹腔感染白假丝酵母菌的情况下,MBL能够促进CD4+T细胞向Treg细胞亚型的诱导分化,抑制CD4+T细胞向Th17细胞亚型的诱导分化,从而影响Treg/Th17细胞免疫平衡。其调节作用可能通过JAK/STAT信号通路得以实现。
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