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克伦特罗（Clenbuterol,CL）是1种人工合成的β2-肾上腺素受体激动剂,常用作支气管扩张剂,用于支气管哮喘及肺气肿等呼吸疾病所致的支气管痉挛。当其应用剂量达到治疗量的5～10倍时,CL可增强肌肉发育,降低脂肪沉积。由于其特殊的生物学功能常被用做饲料添加剂非法用于动物的饲养。CL具有在体内吸收快,脂溶性高,残留性积累和半衰期长等药理特性,人在食用残留CL肉制品后引起的中毒事件不断发生,所以加强检测CL在肉制品中的残留非常必要。目前的理化检测方法存在仪器化程度高,检测成本高,难于推广等缺点;免疫学分析方法检测CL具有快速简便的特点,而免疫分析方法检测需要有CL的特异性抗体。基因工程重组单克隆抗体化学结构特点与单克隆抗体相同,是具有稳定的免疫特异性的1类抗体。其中,单链抗体（singe chain variable fragment,ScFv）具有低或无免疫原性、分子量小、组织穿透力强、成本低、可大规模生产等特点。ScFv可以通过噬菌体展示技术或核糖体展示技术加以制备。核糖体展示技术（RD）是1种完全不依赖于细胞的体外展示技术,库容量远远大于应用较成熟的噬菌体展示技术,此外RD还具有建库和筛选方法简便,没有选择压力,通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点。本文利用RD技术构建了有效容量4.24×1013的鼠源天然ScFv文库,并且从以下几个方面对文库进行了鉴定:可扩增性和多样性、转录和反转录活性、蛋白表达活性。利用重氮化法合成了CL-BSA全抗原。采用固相筛选法用制备的ScFv库筛选抗CL的抗体,并对抗体进行了特异性和灵敏度的初步分析。具体内容包括:1鼠源天然ScFv文库的构建从未经免疫的5周龄Balb/c、C57小鼠的脾细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第一链后,扩增VH、VL基因片段,大小都为350 bp左右;从载体PT7PD扩增出大小为93 bp RD元件T（包括T7启动子,5′茎环,核糖体结合位点）和大小为294 bp间隔序列P（3′茎环,间隔序列）,以重叠引物延伸法（splicing by overlapextension,SOE）将RD元件T与VH连接,P与VL连接,再将TH和LP连接成全长ScFv片段,大小约为1 100 bp,从而构建了RD鼠源天然抗体库。2鼠源天然ScFv文库质量的鉴定（1）用引物ScFv模板的上游引物T7B和下游引物PRDR扩增ScFv文库得到1 100bp的目的片断,证明文库可扩增性良好。（2）将抗体文库连接PEASY-T3载体,进行测序,测序结果显示抗体序列各不相同,不存在中止密码子和致死突变,多样性良好。（3）用Promega T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System将DNA文库进行体外转录得到500 bp的mRNA单链目的条带,将文库进行反转录得到1 100 bp的特异目的条带,证明文库具有反转录和转录活性。（4）采用TranscendTM Non-Radioactive Translation Detection Systems鉴定文库蛋白表达活性,本系统使翻译产物生物素化,抗体采用碱性磷酸酶标记链亲和素。结果显示40 kD左右处有条带,Western印迹结果显示该产物为抗CL抗体。3利用文库筛选抗CL抗体将构建的ScFv文库进行体外转录翻译后,以人工抗原CL-BSA为靶标,利用固相亲和方法筛选抗CL抗体,通过改变Mg2+浓度将筛选得到的单链抗体-核糖体-mRNA（ARM）三联体解离,得到相应的mRNA,经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。通过多轮生物淘筛,ScFv高度特异富集,经过测序比对最终获得抗CL抗体序列。将该抗体序列在大肠杆菌中进行高效表达得到特异蛋白条带,经WB印迹验证该蛋白为抗CL抗体。4对CL抗体灵敏度和特异性的初步分析优化的竞争ELISA条件为:用浓度为20μg/mL的CL-BSA4℃包被过夜,抗体以pH 7.4的PBST缓冲液稀释为1:4 000,竞争抗原与抗体混匀37℃反应1 h后,加入酶标板中再反应1 h,然后加入酶标二抗（以PBST作1:1 000稀释）37℃反应1 h,加底物37℃反应20 min,用2 mol/L H2SO4终止反应,测定OD450。根据上述竞争ELISA条件,以竞争抗原CL的浓度对数为横坐标,竞争抑制率为纵坐标,作图得到CL的抑制曲线,CL的半数抑制浓度(IC50)为1 ng/mL。以肾上腺素激动剂沙丁胺醇、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、畜禽常用的抗菌药物硫酸庆大霉素和维生素A为竞争抗原分析了CL抗体的特异性,CL抗体与上述物质的交叉反应均率均小于0.07%。表现出良好的特异性。