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背景与目的肾小管上皮细胞转分化(tubular epithelial-mesenchymal transition, TEMT)是肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis, RIF)的重要机制之一,肾间质36%的肌成纤维细胞来源于近端肾小管上皮细胞。转分化后的细胞失去其上皮细胞表型,获得间充质细胞特性。有研究表明在糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)患者肾组织中存在TEMT,高糖环境可通过多种途径诱导TEMT,如糖激化终末产物(advanced glycation end products, AGEs).血管紧张素Ⅱ (angiotension Ⅱ, AngⅡ)以及一些细胞因子等。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是细胞在缺氧条件下产生的具有转录活性的核蛋白,能调控细胞在缺氧状态产生应答反应。HIF-1是由功能性亚基a亚基和结构性亚基p亚基组成的异二聚体,在肾脏中主要表达在肾小管上皮细胞。Sun S等发现HIF-1α可诱导TEMT,我们之前的研究证实在DN状态下,肾组织HIF-1α表达增加并参与RIF。近年来,作为HIF-1α靶基因之一的内皮素-1(ET-1)在各种急慢性肾脏病中的作用越来越受到关注。在肾脏中,血管内皮细胞、足细胞、系膜细胞及肾小管上皮细胞均可分泌ET-1,并通过内皮素A受体(ETA)和内皮素B受体(ETB)以自分泌和旁分泌的方式发挥广泛的生物学作用。生理状态下ET-1参与肾小球滤过率、肾脏血流量、肾小管重吸收等多种重要功能的调节。而病理状态下ET-1介导肾脏损伤的途径除了其具有强大的肾脏血管的收缩作用、促进系膜细胞收缩及趋化单核细胞外,还参与促进RIF。 ET-1可通过诱导细胞转分化途径导致糖尿病心肌纤维化,而它是否可通过促进肾小管上皮细胞转分化途径导致RIF而参与糖尿病肾病的发生与发展目前尚不明确。本研究中,观察高糖环境下HIF-la,. ET-1, α平滑肌肌动蛋白(a-SMA), E钙粘蛋白(E-cadherin)的表达情况,以及HIF-lα siRNA转染和ETA受体拮抗剂BQ123对其影响,旨在探讨HIF-lα和ET-1在高糖诱导TEMT中的作用及关系。方法体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株(NRK52E细胞),分组如下：低糖对照组(D-葡萄糖5.6mmol/L),高渗对照组(D-葡萄糖5.6mmol/L+D-甘露醇24.4mmol/L),高糖组(D-葡萄糖30mmol/L),高糖+HIF-lα siRNA转染组,高糖+BQ123预处理组(2μg/ml BQ123预先处理细胞0.5h)。采用相差显微镜观察细胞形态；酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清液ET-1的表达；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和western印迹法分别检测HIF-lα, α-SMA和E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平。结果1.相差显微镜观察显示,低糖对照组NRK52E细胞排列紧密,贴壁生长,呈“铺路石”状。经高糖培养液(D-葡萄糖30mmol/L)培养48h后,细胞逐渐变大变长,呈梭形改变,排列紊乱,少部分细胞脱落。高糖+HIF-lα siRNA组和高糖+BQ123组细胞与低糖对照组相比,多数细胞保持椭圆形或多边形上皮细胞形态,但细胞间距增大。2.与低糖对照组比较,高糖组HIF-lα, ET-1. α-SMA蛋白及mRNA表达均明显增加,E-cadherin蛋白及mRNA表达明显减少,差异均有统计学意义(均P<0.05)。3.与高糖组比较,高糖+HIF-lα siRNA组和高糖+BQ123组α-SMA蛋白及mRNA表达减少,E-cadherin蛋白及mRNA表达增加,差异均有统计学意义(均P<0.05)。4.与高糖组比较,高糖+HIF-lα siRNA组ET-1蛋白及mRNA表达减少,差异有统计学意义(P<0.05),而高糖+BQ123组HIF-lα蛋白及mRNA表达水平无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.高浓度葡萄糖可诱导HIF-1a和ET-1在肾小管上皮细胞中高表达。2.拮抗ET-1的作用可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化。3.高糖环境下HIF-lα活化,ET-1高表达,这一通路可能是导致糖尿病肾病肾间质纤维化的机制之一。