目的:汽化过氧化氢(VHP)是一种高效、无毒、无残留的化学消毒剂,随着越来越多的人对绿色消毒剂的关注,VHP消毒净化系统被广泛应用于医院、微生物实验室、制药行业、食品制造生产等领域。对消毒效果的快速、准确评价在提高生物安全水平,降低病原微生物污染的风险,控制微生物污染等方面都具有重要意义。杀灭率是评价消毒效果的唯一指标,当前许多可用实现活/死菌区分鉴定的方法都可用于对消毒效果的定量评价,包括平板培养法、聚合酶链式反应(PCR)、显微荧光计数法、流式细胞检测法等。其中平板培养计数法是检测消毒效率的标准方法,该方法通过测量生物指示剂中的活菌含量实现对消毒效果的评价,对实验器材的要求低、检测成本低,然而检测过程耗时长,不适用于对消毒效果的即现场评价;PCR检测法技术成熟、灵敏度高、特异性强,但是对检测环境要求高,仪器价格昂贵;显微荧光计数法可以直观地给出检测结果,但是操作繁琐,需要专业技术人员进行操作;流式细胞检测法敏感性高、分析全面,然而检测通量较小,且检出限一般在10~3～10~4cfu/ml。因此,建立一种快速、准确的消毒效果评价方法对指导消毒工作具有重要意义。针对这一实际需求,本研究提出一种基于单细胞荧光成像技术的消毒效果快速评价方法,可以对活/死菌准确识别以及定量分析,实现对消毒效果的快速、准确评价。内容:本研究主要分为以下几个部分:(1)样本前处理方法研究。通过查阅资料及咨询相关专业人员,将样本处理的重点研究分为活/死菌区分荧光染色的实现以及细菌富集方法的对照研究。研究通过对比不同荧光染料对细菌的染色效果,选择荧光性能优异、光谱分离度高能显著区分活/死菌的荧光染料。在细菌富集方面,研究对比了不同裸磁珠对磁细菌的吸附效果,同时探讨了膜过滤法和磁珠吸附法的富集效率,分析了两种方法在实际应用中的优缺点。在总结前处理流程的基础上,研究还初步设计了一种单次检测试剂封装检测卡,对下一步检测过程的集成化具有重要意义。(2)检测系统光路设计研究以及信号处理算法优化设计。系统光路设计主要包括两个激发光源同步扫描的实现、对激光的扩束整形处理、两路荧光探测通道的设计以及主要组成部件的选择。研究通过Lab VIEW程序实现对信号的采集与仪器控制信号的输出。而后编写Mat Lab图像处理算法对采集到的两路信号进行处理,提取有效荧光信号,完成扫描图像细菌分布图像的重建,计算死菌百分比含量,实现测量结果直观、直接地展示。(3)检测系统性能验证。以荧光微球作为检测对象,对照荧光显微镜,实现对扫描检测系统的光路系统进行检验和校准。在完成对扫描系统的初步测试后,以染色细菌作为检测对象,对系统的准确性、可靠性以及检测范围进行了测量。(4)在VHP消毒效果评价中的实际应用测试。方法:针对消毒效果评价的实际需求,通过调研当前活/死菌区分检测技术,提出一种基于单细胞荧光成像技术的消毒效果评价方法。研究主要包括样本前处理方法研究、扫描检测系统研究、系统综合性能评价及消毒效果评价应用四个部分,前两部分工作采用先独立开展,再合并优化的方式完成,即两部分工作独立进行实验研究,在独立性能解决后再将样本处理和样本检测有机融合起来,对系统性能进行实验验证,而后评价其在消毒效率检测中的实际应用效果。在样本前处理研究工作中,采用文献调研结合实验验证的方法解决样本前处理的技术难题。双通道激光扫描探测系统的研制主要采用光学系统设计、实验样机试制及处理算法优化设计的研究方法。而后分别以荧光微球和荧光染色细菌为检测对象,对检测系统性能进行评价。在完成样机性能评价和优化后,以实际VHP消毒后的细菌样本为检测对象,对照平板培养法,测试该方法在消毒效果评价中的实际应用。结果:本文提出并建立了一种基于单细胞荧光成像技术的活/死菌区分检测方法,基于此方法建立了双通道激光扫描同步探测系统,制作完成了实验样机。与荧光显微镜进行对照,系统分辨率高、灵敏性强、一致性好。在VHP消毒效果评价实验中,相比于标准的平板计数法,该方法平均检测效率可达98.47±1.55%,耗时短,能实现对消毒效果的准确、快速评价。此外,该方法在对低浓度枯草芽孢杆菌黑色变种(ATCC 9372)浓度的检测中,与平板计数法相关度高(R~2=0.9971),表明其在微量微生物检测中具有一定优势。结论:立足于消毒效果评价的重要性,通过广泛调研,充分了解当前消毒效果检测领域国内外常用计数方法的优缺点,提出基于单细胞荧光成像技术的消毒效果评价方法的研究。结合双荧光染色标记技术以及荧光显微成像技术,根据样本特点,设计双通道激光扫描同步探测系统,搭建双通道激光扫描同步探测系统平台,实现对活/死菌的同步快速检测。该方法不仅可用于对消毒效果的快速评价中,在微生物定量分析检测领域具有广阔应用前景。