论文部分内容阅读
猪传染性胃肠炎病毒是引起猪腹泻的重要病原之一,猪传染性胃肠炎广泛存在于全世界,给养猪业带来了巨大的损失,因此猪传染性胃肠炎病毒一直是猪病研究的热点之一。M蛋白是TGE病毒粒子的主要结构蛋白,在病毒粒子的装配过程中起到重要作用,能够诱导机体产生干扰素。由于M基因序列高度保守,所以对M基因的研究为猪传染性胃肠炎病毒分子生物学诊断侯选基因提供了理论依据。本研究将阳性质粒pGEX-TGEV-M在大肠杆菌表达系统中进行诱导表达,以表达纯化后的M蛋白作为靶蛋白,利用噬菌体展示随机12肽库对其进行了5轮淘选,在第2轮淘选时筛除标签蛋白,5轮淘选后筛选出10个与TGEV M蛋白特异性结合的噬菌体单克隆,将其中与M蛋白结合效果相对最高的三个噬菌体分别命名为phTGEV-M5、phTGEV-M6、phTGEV-M7,并对它们进行了深入的研究,包括建立了基于噬菌体的鉴别诊断方法,这种方法能够将TGEV从其它六种猪源病毒中成功的区分出来,实验证明所筛选的噬菌体对TGEV的特异性。此外本研究还对phage-ELISA、antibody-ELISA以及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的敏感性进行了比较,实验结果显示phage-ELISA的敏感性介于antibody-ELISA和RT-PCR之间。本研究将与病毒反应性最高的7号噬菌体(HALTPIKYIPPG)合成多肽,命名为pepTGEV-M7,评价它的抗病毒能力。实验证明了多肽能够与M蛋白特异性结合,蚀斑减少实验揭示了pepTGEV-M7预先与病毒混合后再孵育细胞这种作用方式能够显著降低TGEV在体外的感染(p<0.01)。利用间接免疫荧光实验和实时荧光定量RT-PCR实验证实了pepTGEV-M7与猪氨肽酶N多肽pepF (FKPSSPPSITLW)联合应用后对TGEV的抑制效果较单独使用pepTGEV-M7多肽要好。并且多肽呈剂量依赖性的方式对病毒产生抑制作用。