杜氏肌营养不良(DMD)是一种致死性X连锁隐性遗传病，该疾病是由于DMD基因的突变造成Dystrophin蛋白的缺失或功能丧失所致，目前临床上对该疾病尚无有效的治疗手段，而基因治疗的兴起为DMD治疗带来了新的希望。本研究首先以逆转录病毒诱导DMD患者皮肤成纤维细胞(HDFs)成为DMD病人特异性ips细胞（DFiPS），然后构建新型非病毒核糖体区基因打靶载体pHr2-nl-CDysG，并对上述ips细胞进行打靶的初步实验研究。为将Minidystrophin基因定点整合至iPS细胞基因组中，筛选稳定表达Minidystrophin蛋白的iPS细胞克隆奠定了基础，也为采用ex vivo（间接体内）途径进行DMD基因治疗开辟一条新的思路。　　第一部分:DMD患者皮肤成纤维细胞诱导自体多潜能干细胞　　目的:利用皮肤成纤维细胞诱导建立DMD疾病特异型ips细胞系。　　方法:利用逆转录病毒介导的转染系统将四种经典转录因子Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4导入DMD患者皮肤成纤维细胞，并且在诱导过程中添加小分子Vc和VPA，最终获得DMD患者来源的iPS细胞。通过细胞形态学、碱性磷酸酶染色、干细胞表面多潜能标志物染色及细胞核型检测对传代后的克隆进行鉴定。　　结果:(1)将包装质粒和逆转录病毒载体通过脂质体 Lipofectamine2000共同转染293T细胞后，获得优质逆转录病毒;(2)诱导出细胞克隆形态上与iPS细胞相似，挑取上述克隆传代，碱性磷酸酶染色呈阳性，iPS细胞表面标志免疫荧光检测呈阳性。传至P9代，仍然具有iPS样克隆形态。(3)通过细胞染色体核型检测显示诱导后细胞没有发生染色体水平的突变。　　结论:利用逆转录病毒系统将DMD患者皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，通过细胞核型、表面标志物及体外分化等鉴定DMD疾病特异型iPS细胞系的全能性。　　第二部分:新型DMD基因治疗载体的构建及打靶探究　　目的:构建携带Minidystrophin治疗基因的新型非病毒核糖体基因区打靶载体，通过打靶将Minidystrophin基因定点整合至DFiPS细胞基因组中，筛选稳定表达Minidystrophin蛋白的DFiPS细胞克隆。　　方法:(1) pHr2-nl-CDysG打靶载体的构建:首先用PCR克隆CAG启动子和BGH PolyA，然后将其正向连入pGEM-T Easy载体当中。从本室构建的核糖体基因区打靶载体pHrneoDysG中酶切下DysG融合基因，连入CAG启动子和BGH PolyA之间。再将CAG-DysG-BGH片段从pGEM-T Easy载体上切下，连入本室构建的新型核糖体基因区打靶载体pHr2-nl中，得到DMD基因治疗载体pHr2-nl-CDysG。(2)采用核转染的方法转染单细胞化的DFiPS细胞，并在转染后加入Y27632提高细胞存活率。　　结果:(1)构建的载体pHr2-nl-CDysG经PmeⅠ和AhdⅠ酶切鉴定，所获得的酶切片段大小与理论值相符。(2)载体pHr2-nl-CDysG的测序结果与理论序列相符。(3)将pHr2-nl-CDysG核转到DFiPS细胞中，可观察到一定数量iPS细胞eGFP基因的表达。　　结论:成功构建新型核糖体基因区打靶载体pHr2-nl-CDysG。其将应用于DMD患者来源的iPS细胞打靶研究。