研究背景和研究目的结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率呈逐年上升和年轻化的趋势。转移是结直肠癌患者死亡的主要原因。肿瘤转移是由肿瘤细胞内在的特性改变所决定的,但是随着对肿瘤研究的深入,人们已经越来越认识到肿瘤微环境在肿瘤的发生及演进中扮演着重要的角色。研究和治疗肿瘤不能只考虑肿瘤本身的改变,同时还要考虑微环境对肿瘤的影响。炎性微环境与肿瘤的发生和转移密切相关,为肿瘤细胞增殖、恶性演变提供了“肥沃土壤”。在很多恶性肿瘤(如乳腺癌、胃腺癌、卵巢癌等)中,肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAM)是肿瘤间质中浸润较多的一类炎性细胞,具有促进肿瘤生长、侵袭、迁移、血管生成和转移等作用。根据巨噬细胞参与免疫应答反应的不同,可将巨噬细胞分为两大类:M1型即经典活化的巨噬细胞(classically activated macrophage)和M2型替代活化的巨噬细胞(alternatively activated macrophages)。本课题组前期研究已经验证结直肠癌组织侵袭边缘浸润的TAM主要为M2型巨噬细胞,它能够促进结直肠癌细胞的侵袭与迁移,并且筛选出M2型巨噬细胞能够优势分泌Galectin-1,Galectin-1在结直肠癌中主要在肿瘤间质表达,围绕在肿瘤细胞周围,与TAM有共定位。Galectin-1作为一种胞内效应器穿梭于细胞核和细胞质之间,在细胞的增殖、粘附以及免疫等活动中发挥重要的作用,研究显示Galectin-1可能参与了肿瘤的侵袭和转移过程,但其促进肿瘤细胞侵袭和转移的分子机制尚不清楚。本课题组通过免疫荧光、质谱分析和Far-western bloting等实验技术检测到结直肠癌细胞膜上存在的Galectin-1的特异性受体之一为MYO1B。MYO1B是非常规肌球蛋白myosin家族的一员,主要位于细胞膜波形边缘或者皱褶处,MYO1B基因定位于染色体2q12-q34,全长234kb。MYO1B蛋白是单聚体结构。有研究表明,myosin I与物质运输、细胞骨架功能维持有关,并且MYO1B在细胞膜的伸出部分或者板状伪足呈现高浓度,提示它可能参与了细胞迁移过程。关于MYO1B与结直肠癌转移的研究,国内外还未见报道。因此,本课题旨在探索M2型巨噬细胞优势分泌的Galectin-1是否通过MYO1B参与结直肠癌侵袭迁移的过程,并阐明MYO1B在结直肠癌侵袭迁移过程中的具体分子机制,以期在结直肠癌转移机制的研究中提供新思路、新策略、新靶点,并能够为临床防治结直肠癌提供可靠的理论基础。研究方法1、Galectin-1与MYO1B相互作用的鉴定采用细胞免疫荧光分析结直肠癌细胞株SW620细胞膜上存在的Galectin-1的特异性受体,采用免疫沉淀、质谱分析发现Galectin-1的特异性受体,并采用Far-western bloting技术验证Galectin-1与MYO1B存在直接相互作用。2、MYO1B在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌细胞体外生物学特性的影响(1)采用免疫荧光的方法检测SW620和SW480细胞株rGalectin-1处理4小时后,分析MYO1B表达情况。(2)采用 RT-PCR 及 western bloting 的方法检测 MYO1B 在 SW480、SW620、HT29、Lovo、HCT116、M5、DLD1、RKO 8株结直肠癌细胞株中的表达;采用RT-PCR技术检测MYO1B在20对结直肠癌组织中的表达;采用WB检测8对结直肠癌组织中MYO1B的表达;采用CCK8、流式细胞术测细胞周期实验、划痕实验、transwell实验在过表达或者干扰MYO1B的SW480和SW620细胞的增殖,迁移能力的变化,采用免疫组织化学单染及双染检测MYO1B在结直肠癌组中的表达,并分析MYO1B在结直肠癌组中的表达与结直肠癌临床病理参数的关系。3、MYO1B参与的结直肠癌信号通路的检测(1)采用免疫沉淀、质谱分析检测MYO1B的下游相互作用蛋白。(2)建立稳定干扰MYO1B表达的SW480、DLD1细胞亚系,并采用RT-PCR及western bloting的方法检测细胞的过表达效率或者干扰效率。采用Western Blotting检测稳定干扰MYO1B表达的SW480、DLD1细胞亚系中Focal adsion信号通路相关蛋白的表达。4、统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。定量的数值用均数(x)±标准差(standard deviation,SD)表示。组织的荧光定量PCR结果△Ct的比较采用配对样本t检验(Paired-samplettext),癌组织中MYO1B的表达与病人临床资料的分析用Fishers确切检验,细胞荧光定量PCR结果2-ct值采用单因素方差分析(One-WayANOVA),方差不齐时采用Welch近似方差分析;方差齐性的多重比较采用 LSD 法、SNK(Student-Newman-Keuls)法,方差不齐时采用 DunnettT3法。MYO1B与临床病理学参数的相关性用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法,两组间比较采用Log-rank test。生存期的多因素分析采用Cox回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、Galectin-1与MYO1B相互作用的鉴定免疫荧光技术检测到SW620细胞膜上存在Galectin-1的特异性受体,通过免疫沉淀及质谱分析技术鉴定Galectin-1的特异性受体为MYO1B,通过免疫沉淀及Far-western blot技术验证了 Galectin-1与MYO1B存在直接相互作用。2、MYO1B在结直肠癌细胞株及结直肠癌组织中的表达免疫荧光方法检测结果显示SW620、SW480细胞经rGalectin-1处理后,其膜上的MYO1B表达增高;RT-PCR及western bloting的方法检测结果显示MYO1B 在 SW480、SW620、HT29、Lovo、HCT116、M5、DLD17株结直肠癌细胞株中差异表达,其中在HT29细胞中表达最低,DLD1、SW620、SW480、HCT116细胞中表达较高,且差异具有统计学意义(P<0.01);RT-PCR技术检测MYO1B在20对结直肠癌组织及配对正常组织中的表达,结果显示癌组织高于正常组织,且差异有统计学意义(P<0.05);West-blotting检测8对结直肠癌组织及配对正常组织中的表达,结果显示癌组织高于正常组织;免疫组织化学单染显示MYO1B在结直肠癌组织中表达强于正常结直肠组织,免疫组化双染显示CD68和CD163在癌周组织巨噬细胞表达阳性;MYO1B在癌组织阳性表达,临床病理参数分析显示MYO1B高表达与淋巴结转移、生存预后相关。CCK8、细胞周期实验结果显示过表达或者干扰MYO1B的SW480、SW620细胞与对照组相比无明显差异,不具有统计学意义;划痕、Tanswell实验结果显示过表达MYO1B的SW480、SW620细胞与对照组相比,细胞的迁移以及侵袭能力高于对照组;而干扰MYO1B的SW480、SW620细胞与对照组相比,细胞的迁移以及侵袭能力低于对照组,差异均具有统计学意义。3、MYO1B参与的结直肠癌信号通路的检测免疫沉淀、质谱分析检测到MYO1B的下游相互作用蛋白为RACK1。RT-PCR和western bloting方法检测结果显示:DLD1、SW480干扰细胞株与对照组相比,MYO1B表达量低于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.01)。干扰组Focal adsion信号通路相关蛋白Paxillin表达量低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论1、M2型巨噬细胞分泌的Galectin-1的特异性受体为MYO1B。2、MYO1B在结直肠癌组织中的表达量高于正常肠粘膜组织,MYO1B高表达与淋巴结转移相关,与结直肠癌患者的生存预后相关。3、M2型巨噬细胞分泌的Galectin-1通过与结直肠癌表面的受体MYO1B结合,并与下游相互作用蛋白RACK1相互作用,通过影响Focal adsion信号通路相关蛋白Paxillin表达参与细胞黏附的过程,从而促进结直肠癌细胞的侵袭与转移。