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研究背景与目的:心肌纤维化(Myocardial fibrosis,MF)是当心肌受到各种外界损伤,例如机械压力、炎症刺激和局部缺血时,发生心肌适应性重塑的过程。MF最具特征的一个病理改变则是相关炎性细胞和活化的心肌成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)积聚,继而引起细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的生成随之剧增。不少证据表明,以心室收缩和舒张功能障碍为特征的心力衰竭(heart failure,HF)表现出严重MF。由于HF预后较差,对大多数心血管疾病患者的健康构成极大威胁。因此,积极寻找MF有效的干预措施对延缓HF的疾病进程具有重大意义。MF的发展受多种因素的影响,其中氧化应激和炎症反应均参与其中,炎症因子,如TNF-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6(interleukin-6,IL-6)和IL-1β等均与其发展密切相关。Lgr5是一种G蛋白偶联受体,有研究发现R-spondin能够与Lgr5结合,从而引起Wnt/β-Catenin信号转导的激活。同时,有多个研究报道,Wnt/β-Catenin信号转导在MF的疾病进展过程中扮演着非常重要的角色。我们研究团队在前期的细胞实验中发现Lgr5影响心肌纤维化的分子机制可能是通过Wnt/β-Catenin信号途径实现。本研究旨在探索特异性敲除心肌组织中的Lgr5在异丙肾上腺素(Isoprenaline,ISO)诱导小鼠心肌纤维化动物模型中的作用及机制。研究利用心肌组织中Lgr5特异性基因敲除小鼠,采取皮下注射ISO制造心肌纤维化动物模型,研究特异性敲除心肌组织中的Lgr5对MF的影响,同时检测wnt1、β-Catenin的变化情况,验证特异性敲除心肌组织中的Lgr5影响心肌纤维化的分子机制是否通过Wnt/β-Catenin信号途径实现。材料与方法:1、ISO诱导小鼠心肌纤维化动物模型实验选择C57BL/6J遗传背景的野生小鼠(体重20-25g,年龄8-10周龄的健康小鼠20只),分成2组,采用皮下注射Vehicle/ISO 30mg/kg/d,连续10天制造心肌纤维化动物模型,检测小鼠体重、心率、血压,Massson染色确定心肌纤维化模型是否制造成功,RT-PCR和Western blotting测定Lgr5、collagen I和collagenⅢ的表达情况。2、特异性敲除心肌组织中的Lgr5对小鼠心肌纤维化的影响实验利用C57BL/6J遗传背景心肌组织中Lgr5特异性基因敲除小鼠与同窝野生小鼠(体重20-25g,年龄8-10周龄的健康小鼠各20只)分成4组:WT+Veh组、WT+ISO组、Lgr5 cKO+Veh组、Lgr5 cKO+ISO组来进行心肌纤维化动物模型的制造,观察特异性敲除心肌组织中的Lgr5对小鼠体重、心率、血压、心功能、心肌纤维化程度、心肌炎症反应的影响,RT-PCR和Western blotting检测collagen I、collagenⅢ、MMP1、TIMP1、IL-6、TNF-α的表达来研究特异性敲除心肌组织中的Lgr5对小鼠相关纤维化指标的影响。3、特异性敲除心肌组织中的Lgr5在小鼠心肌纤维化中的作用机制实验利用RT-PCR和Western blotting测定Lgr5、wnt1和β-Catenin的表达,验证特异性敲除心肌组织中的Lgr5是否通过Wnt/β-Catenin信号途径影响小鼠心肌纤维化。结果:1、ISO诱导小鼠心肌纤维化动物模型结果发现,与Veh组相比,ISO组体重下降,心率及心脏重量指数增加(P<0.05);ISO组的收缩压和Veh组相比几乎无变化,舒张压比Veh组稍变低,但差异不具备统计学意义;Masson染色发现ISO组的心肌纤维化程度比Veh组更严重,胶原面积显著增加(P<0.05),证明用此剂量的ISO注射后,心肌纤维化模型已经成功制造;RT-PCR和Western blotting测定结果示,ISO组的Lgr5、collagen I和collagenⅢ的表达较Veh组有所增加(P<0.05)。以上结果说明,选定剂量的ISO成功诱导了心肌纤维化动物模型,并且在心肌纤维化中,Lgr5表达增加,Lgr5可能参与ISO诱导的小鼠心肌纤维化。2、特异性敲除心肌组织中的Lgr5对小鼠心肌纤维化的影响结果发现,各组血压无明显改变;与Veh组相比,ISO组体重下降(P<0.05),且WT+ISO组较Lgr5 cKO+ISO组下降更明显,但差异不具备统计学意义,ISO组心率及心脏重量指数较Veh组增加,且WT+ISO组较Lgr5 cKO+ISO组增加更明显(P<0.05);WT+ISO组的EF和FS值都较WT+Veh组变低、LVIDs值较WT+Veh组有所上升(P<0.05),LVIDd值也有上升趋势,但差异不具备统计学意义;与Lgr5 cKO+Veh组相比,Lgr5 cKO+ISO组EF值变低(P<0.05),FS值变低、LVIDs与LVIDd值有所上升,差异不具备统计学意义;与Lgr5 cKO+ISO组相比,WT+ISO组的EF值变低(P<0.05),FS值也有变低的趋势、而LVIDs和LVIDd值有所上升,但差异都不具备统计学意义;Masson及天狼星红染色发现ISO组胶原容积分数增加,且WT+ISO组较Lgr5 cKO+ISO组增加更明显(P<0.05);HE染色Veh组心脏组织基本正常,ISO组心脏组织发生不同程度的炎细胞浸润,其中WT+ISO组较Lgr5 cKO+ISO组更严重,并出现纤维组织增生;RT-PCR和Western blotting测定结果示,与Veh组相比,ISO组collagen I、collagenⅢ、TIMP1、IL-6、TNF-α的表达增加,MMP1表达降低,且WT+ISO组较Lgr5 cKO+ISO变化更明显(P<0.05)。以上结果说明,特异性敲除心肌组织中Lgr5可以减轻ISO诱导的小鼠心肌纤维化。3、特异性敲除心肌组织中的Lgr5在小鼠心肌纤维化中的作用机制结果发现,与WT+Veh组相比,WT+ISO组Lgr5 mRNA及蛋白表达增加(P<0.05),Lgr5 cKO+Veh组和Lgr5 cKO+ISO组的Lgr5 mRNA及蛋白几乎不表达;与Veh组相比,ISO组wnt1和β-Catenin的mRNA与蛋白表达量都有所上升,且WT+ISO组较Lgr5 cKO+ISO组上升更明显(P<0.05),提示特异性敲除心肌组织中的Lgr5减轻心肌纤维化的分子机制是通过下调Wnt/β-Catenin信号途径实现。结论:1.特异性敲除心肌组织中的Lgr5可以减轻心肌纤维化。2.特异性敲除心肌组织中的Lgr5减轻心肌纤维化的分子机制是通过下调Wnt/β-Catenin信号途径实现。