论文部分内容阅读
[目 的]肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）作为原发性肝癌最常见的类型（下文所述肝癌均指肝细胞癌）,其发病率及死亡率均处恶性肿瘤前列,多数患者死于肝癌的侵袭和转移。而具有细胞外基质降解能力的侵袭性伪足（Invadopodia）,被认为是HCC侵袭转移的关键,但侵袭性伪足形成及功能的调控机制仍未完全阐明。近年来,大量研究证实长链非编码RNA（longnon-coding RNA,lncRNA）在恶性肿瘤的侵袭转移过程中发挥着重要作用,然而关于lncRNA对侵袭性伪足形成及功能的调控机制却鲜有报道。本课题组前期系列研究观察到抑癌基因Hint1的表达抑制与HCC细胞侵袭性伪足的形成密切相关,考虑到Hint1基因表达产物三联组氨酸核苷酸结合蛋白1（Histidine triad nucleotide-binding protein 1,HINT1）的转录调节活性,课题组猜测HCC细胞内HINT1的表达缺失可能引发细胞内非蛋白编码基因的转录紊乱,导致某些侵袭性伪足相关lncRNA的表达异常,从而影响HCC细胞的侵袭和转移。因此,本研究以前期获得的HINT1敲低前后HCC细胞lncRNA+mRNA芯片检测数据为线索,旨在:1.寻找参与HCC细胞侵袭性伪足形成（功能）调控的关键lncRNA,并明确其在HCC中的表达特征及预后价值;2.探索该lncRNA表达对HCC细胞侵袭性伪足形成（功能）及侵袭、迁移行为的影响;3.探讨该lncRNA调控HCC细胞侵袭性伪足形成（功能）的分子机制。[方法]寻找HINT1敲低前后差异表达的关键lncRNA并明确其在肝癌细胞系及癌组织中的表达特征及临床意义:（1）利用lncRNA+mRNA芯片数据及生物信息学技术筛选HINT1敲低前后肝癌细胞内差异表达的lncRNA,结合目前lncRNA研究进展,从表达差异较为显著的lncRNA中选取目标lncRNA;（2）利用逆转录定量聚合酶链反应（Reverse Transcription quantitative PCR,RT-qPCR）检测目标lncRNA在永生化肝细胞系HL-7702及不同侵袭性特性的肝癌细胞系（HepG2、Huh7、SK-Hep1及MHCC97-H）中的表达特征;（3）对收集的80例肝癌组织及其配对的癌旁组织行RT-qPCR检测及原位杂交染色（Chromogenic in situ Hybridization,CISH）明确肝癌及癌旁组织内目标lncRNA的表达特征,同时利用TCGA（The Cancer Genome Atlas）在线数据库中的肝癌（368例）及癌旁（50例）标本转录组数据对目标lncRNA表达进行生物信息学分析验证;（4）利用Kaplan-Meier曲线分析80例肝癌组织内目标lncRNA表达与对应的肝癌患者总生存率（Overall Survival,OS）及无病生存率（Disease Free Survival,DFS）间的关系,并利用TCGA数据库进行大样本验证;（5）利用Cox回归模型对80例HCC患者OS及DFS相关因素（目标lncRNA表达水平、性别、年龄、HBV感染、AFP及ALT高低、肿瘤大小、肿瘤多灶性及血管转移（包括门静脉及微血管侵犯））分别进行单因素及多因素分析;（6）利用Spearman相关性分析明确目标lncRNA表达与肝癌患者临床病理参数间的关系。探索目标lncRNA（经上一部分结果分析确定为EPB41L4A-AS1）表达对肝癌细胞侵袭、迁移行为的影响:（1）分别利用携带有EPB41L4A-AS1慢病毒过表达载体/shRNA表达载体的慢病毒颗粒感染EPB41L4A-AS1相对低表达的Huh7细胞/相对高表达的SK-Hep1细胞,并利用嘌呤霉素筛选出EPB41L4A-AS1稳定高表达的Huh7细胞及稳定低表达的SK-Hep1细胞;（2）Transwell实验检测EPB41L4A-AS1表达对Huh7/SK-Hep1细胞迁移及侵袭能力的影响;（3）RT-qPCR 及 Western blot 实验检测 EPB41L4A-AS1 表达对 Huh7/SK-Hep1 细胞上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）相关蛋白表达的影响;（4）利用激光扫描共聚焦荧光显微镜（Laser scanning confocal microscopy,LSCM）,分别通过侵袭性伪足形成及凝胶溶解实验检测EPB41L4A-AS1表达对Huh7/SK-Hep1细胞侵袭性伪足形成及功能的影响;（5）利用裸小鼠尾静脉注射肺转移模型及裸小鼠肝内成瘤模型比较接种EPB41L4A-AS1稳定低表达SK-Hep1或野生型SK-Hep1细胞后,裸小鼠肺内及肝内微转移灶数量,评估EPB41L4A-AS1表达在体内对肝癌转移的影响。EPB41L4A-AS1调控肝癌细胞侵袭性伪足形成和功能的分子机制的探索:（1）利用荧光原位杂交技术（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）及核质分离RT-qPCR实验检测肝癌细胞内EPB41L4A-AS1的分布情况;（2）利用生物信息学技术构建肝癌细胞内EPB41L4A-AS1相关竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络,结合近期发表的侵袭性伪足调控相关基因集,明确其中哪一（几）条ceRNA调控轴参与了 EPB41L4A-AS1介导的侵袭性伪足形成及功能调控;（3）利用RT-qPCR、Western blot及免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）染色检测肝癌细胞及组织中该ceRNA调控轴参与者表达关系;（4）分别或共转染对应的过表达质粒、siRNA、miRNA inhibitors/mimics操纵ceRNA调控轴参与者表达后,利用RT-qPCR及Western blot检测肝癌细胞内ceRNA调控轴参与者间的调控关系;（5）利用双荧光素报告酶基因检测及RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）技术证实,EPB41L4A-AS1 通过 miRNA 应答单元（microRNA response elements,MRE）与轴内miRNA特异性结合,从而抑制miRNA对靶mRNA的降解;（6）分别或共转染对应的过表达质粒、siRNA及miRNA inhibitors/mimics操纵ceRNA调控轴参与者的表达,利用LSCM（通过侵袭性伪足形成及凝胶溶解实验）及Transwell实验观察肝癌细胞侵袭性伪足形成（功能）及肝癌细胞侵袭、迁移能力的变化;（7）利用Western blot检测ceRNA轴对下游侵袭性伪足形成相关蛋白表达（及磷酸化）的调控。[结 果]EPB41L4A-AS1在肝癌细胞系及癌组织中的表达及临床意义:（1）EPB41L4A-AS1在HINT1敲低后的肝癌细胞内显著高表达;（2）EPB41L4A-AS1在肝癌组织及细胞系中的表达水平显著高于癌旁组织及永生化肝细胞系,且高侵袭性肝癌细胞系（SK-Hep1、MHCC97-H）内EPB41L4A-AS1表达水平高于低侵袭性细胞系（Huh7、HepG2）;（3）EPB41L4A-AS1的表达水平与肝癌患者的预后关系密切,且其表达水平是影响HCC患者DFS的独立预后因素;（4）EPB41L4A-AS1的表达水平与肝癌患者的TNM分期、肿瘤多灶性、血管转移正相关。EPB41L4A-AS1对肝癌细胞侵袭、迁移行为的影响:（1）体外实验显示,稳定过表达EPB41L4A-AS1的Huh7细胞较野生型Huh7细胞侵袭及迁移能力、侵袭性伪足形成及功能明显提升,且上皮细胞标志蛋白E-钙黏蛋白（E-Cadherin,E-cad）表达明显降低,间质细胞标志蛋白纤维粘连蛋白（Fibronectin,FN）、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth Muscle Actin,α-SMA）表达明显升高;而稳定低表达EPB41L4A-AS1的SK-Hep1细胞侵袭及迁移能力、侵袭性伪足形成及功能明显降低,FN及α-SMA表达明显下调,而E-cad表达明显上调;（2）体内实验显示,接种稳定低表达EPB41L4A-AS1的SK-Hep1细胞的裸小鼠肺组织及肝组织内微转移灶数量明显少于接种野生型SK-Hep1细胞的裸小鼠。EPB41L4A-AS1调控肝癌细胞侵袭性伪足形成和功能的分子机制:（1）FISH及核质分离RT-qPCR检测发现EPB41L4A-AS1主要分布于肝癌细胞胞质;（2）利用前期获得的lncRNA+mRNA表达谱芯片数据,结合生物信息技术构建了以EPB41L4A-AS1为中心,7个miRNAs和10个mRNAs为节点的ceRNA调控网络,结合已经发表的侵袭性伪足调控相关基因集,进一步筛选出可能参与侵袭性伪足形成调控的 ceRNA 机制调控轴:EPB41L4A-AS1/miR-20b-5p/MCL1;（3）RT-qPCR及Western blot检测发现,MCL1在Huh7细胞内的表达明显低于SK-Hep1 细胞,而 miR-20b-5p 在两个细胞中的表达未见明显差异。IHC 染色显示裸鼠EPB41L4A-AS1低表达微转移灶组织内MCL1表达高。50例肝癌组织（由收集的80例肝癌组织中随机选出）中MCL1的表达与EPB41L4A-AS1的表达正相关,与miR-20b-5p表达呈负相关,且EPB41L4A-AS1的表达与miR-20b-5p表达负相关;（4）转染miR-20b-5pinhibitors或EPB41L4A-AS1过表达质粒均可显著增加肝癌细胞内MCL1的表达,且因转染miR-20b-5pmimics对MCL1表达的抑制可被EPB41L4A-AS1或MCL1的过表达质粒的转染所挽救;（5）双荧光素报告酶基因实验显示miR-20b-5p mimics或inhibitors与野生型EPB41L4A-AS1或野生型MCL1的荧光素酶报告基因质粒共转染,可检测到荧光素酶活性的显著降低或升高,而与miR-20b-5p推定结合位点突变型EPB41L4A-AS1或MCL1质粒或对照质粒共转染则未见荧光素酶活性的明显变化,且共转染EPB41L4A-AS1过表达质粒,可逆转由miR-20b-5pmimics转染介导的MCL1野生型荧光素酶的活性抑制;（6）RIP实验显示在HCC细胞中EPB41L4A-AS1、miR-20b-5p及MCL1均在AGO2复合物中富集,且敲低EPB41L4A-AS1可观察到MCL1在AGO2上的富集显著增加;（7）LSCM观察侵袭性伪足形成及功能实验显示,含有标志侵袭性伪足形成及基质胶溶解斑点的HCC细胞比例在转染EPB41L4A-AS1 siRNA后明显减少,且miR-20b-5p inhibitor或MCL1过表达质粒的转染可部分挽救因转染EPB41L4A-AS1 siRNA对侵袭性伪足形成及功能的负面影响;（8）Transwell实验显示,HCC细胞在转染EPB41L4A-AS1 siRNA后侵袭、迁移能力明显减弱,且miR-20b-5p inhibitor或MCL1过表达质粒的转染可部分挽救因转染EPB41L4A-AS1 siRNA对肝癌细胞侵袭及迁移能力的抑制作用;（9）Western blot实验显示,转染EPB41L4A-AS1过表达质粒可在总Cofilin表达量不变的情况下降低3号丝氨酸位点（Ser3,S3）磷酸化的Cofilin（Cofilin S3phox）比例,而EPB41L4A-AS1表达下调引起的Cofilin S3phox比例增加亦可被miR-20b-5p inhibitor或MCL1过表达质粒的转染所挽救。[结 论]本研究首次报道,在肝癌细胞及组织中高表达的lncRNAEPB41L4A-AS1可能是一种新的侵袭性伪足形成及功能的调节因子,其表达与肝癌患者的不良预后关系密切,有望成为肝癌患者不良预后的生物标志物。机制上,本研究首次证实EPB41L4A-AS1可通过ceRNA机制竞争性结合miR-20b-5p,抑制miR-20b-5p靶向MCL1,进而通过上调MCL1的表达,抑制侵袭性伪足形成调控分子Cofilin Ser3位点的磷酸化,促进肝癌细胞侵袭性伪足形成及功能。本研究丰富了我们对lncRNA调控侵袭性伪足的形成及功能的认识,部分阐明了肝癌侵袭转移的分子机制,更为EPB41L4A-AS1作为肝癌转移、复发等不良预后的生物标志物提供实验及理论依据。