【摘 要】
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牛奶因其丰富的营养成分而被称为满足人类营养需求的“全价食物”,而乳脂不仅仅是牛奶的主要能量成分,更决定了乳制品的物理特性,制造特性及感官品质。因此,如何提升乳脂率一直是国内外乳制品产业亟待解决的科学问题,而从分子生物学角度出发研究调控乳脂肪形成的基因网络也已成为该领域的研究热点。越来越多的研究表明,在乳腺上皮细胞中,miRNA可抑制其靶标mRNA的表达,并通过相应的靶基因参与到下游信号的传导途径从
【基金项目】
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陕西省自然科学基金（2021JM-100）； 杨凌示范区协同创新重大项目（K336）；
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牛奶因其丰富的营养成分而被称为满足人类营养需求的“全价食物”,而乳脂不仅仅是牛奶的主要能量成分,更决定了乳制品的物理特性,制造特性及感官品质。因此,如何提升乳脂率一直是国内外乳制品产业亟待解决的科学问题,而从分子生物学角度出发研究调控乳脂肪形成的基因网络也已成为该领域的研究热点。越来越多的研究表明,在乳腺上皮细胞中,miRNA可抑制其靶标mRNA的表达,并通过相应的靶基因参与到下游信号的传导途径从而进一步控制包括乳脂合成在内的多种生物学过程。本研究以奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）为模型,通过脂质体转染法在BMECs中转染miR-34b mimic/inhibitor,首先利用油红O染色,甘油三脂含量（TAG）测定,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）及Western blot技术检测了miR-34b在奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成过程中的具体作用及乳脂合成相关基因表达量的变化;其次利用KEGG对过表达miR-34b组BMECs与对照组BMECs的差异基因进行分析;然后对参与miR-34b调控奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪合成过程中的下游通路进行筛选并利用通路激动剂进行针对miR-34b mimic的挽救实验;之后利用Target Scan预测miR-34b的靶基因并利用双荧光素酶报告载体对其进行验证;最后利用脂质体转染法在BMECs中转染靶基因的siRNA并验证下游信号通路活性。实验结果如下:（1）油红O染色与TAG含量测定结果表明乳腺上皮细胞中miR-34b过表达可抑制甘油三酯的合成;RT-qPCR及Western blot结果表明miR-34b过表达可抑制乳脂合成相关基因mRNA水平及蛋白水平的表达量;而乳腺上皮细胞中miR-34b的抑制则导致了完全相反的结果。（2）转录组测序结果表示miR-34b在奶牛乳腺上皮细胞中的过表达引起了1999基因的上调和2009基因的下调;且KEGG分析显示,miR-34b对乳脂合成的抑制作用可能是通过抑制Akt/mTOR信号传导途径实现的。（3）RT-qPCR及Western blot结果表明miR-34b过表达后可通过抑制Akt/mTOR信号通路关键基因Akt,mTOR,4E-BP1和P70S6K的磷酸化水平从而抑制该通路的活性水平。（4）利用mTOR特异性激动剂MHY1485与miR-34b mimic共同处理乳腺上皮细胞后,油红O染色与TAG含量测定结果表明miR-34b mimic对甘油三脂合成的抑制作用可被MHY1485逆转。（5）使用Target Scan预测miR-34b的靶基因,发现RAI14在其3’-UTR处具有miR-34b结合位点,且双萤光素酶报告实验确定了RAI14为miR-34b的靶基因。（6）乳腺上皮细胞中RAI14的敲低可导致Akt/mTOR信号通路活性的降低,显示RAI14是miR-34b与其下游Akt/mTOR信号通路间的重要媒介。综上,miR-34b通过靶向奶牛乳腺上皮细胞中的RAI14-Akt/mTOR信号通路从而抑制了乳脂的合成,且miR-34b可能在未来成为调节乳脂合成的生物标志物和潜在的治疗靶标,为改善牛乳中的有益成分提供重要参考。
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