【摘 要】
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对水稻等主要粮食作物而言,种子蛋白质含量是一个极其重要的品质性状,但目前对其分子遗传基础与分子调控机理认识有限。本研究以水稻中一个种子蛋白质含量的正调控基因OsAAP6作为研究对象,对其进行了相关的生物信息学分析,并解析OsAAP6的转运功能。同时,利用酵母双杂交技术筛选出与OsAAP6发生相互作用的蛋白并进行了验证,其主要结果如下:1.水稻OsAAP6基因编码区全长为1401 bp,编码466个
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对水稻等主要粮食作物而言,种子蛋白质含量是一个极其重要的品质性状,但目前对其分子遗传基础与分子调控机理认识有限。本研究以水稻中一个种子蛋白质含量的正调控基因OsAAP6作为研究对象,对其进行了相关的生物信息学分析,并解析OsAAP6的转运功能。同时,利用酵母双杂交技术筛选出与OsAAP6发生相互作用的蛋白并进行了验证,其主要结果如下:1.水稻OsAAP6基因编码区全长为1401 bp,编码466个氨基酸残基。OsAAP6蛋白的相对分子量为50.96 kDa,是一个具有11次跨膜结构的疏水性蛋白。对其蛋白结构域进行预测结果表明:OsAAP6蛋白有2个保守结构域,分别是Trp-Try结构域和Aa＿trans结构域,他们分别属于氨基酸透性酶家族和氨基酸转运蛋白家族。对其信号肽进行预测发现1-70个氨基酸残基为其信号肽序列,但这之间并没有发现其信号肽的剪切位点,表明该蛋白可能为非分泌性蛋白。对其蛋白进行二级结构预测,发现其α螺旋居多,无规则卷曲次之,β折叠最少。对其三级结构预测结果也发现其α螺旋居多,与二级结构预测的结果一致。2.通过构建氨基酸缺陷型酵母表达载体PDR195-OsAAP6,转入氨基酸缺陷型酵母22Δ8AA中,并让其在缺陷型酵母细胞中表达。结果表明:OsAAP6蛋白能够同时转运瓜氨酸、精氨酸、γ-氨基丁酸、天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酸,即OsAAP6可能是一种广谱性氨基酸转运蛋白。3.克隆OsAAP6基因编码区序列,利用Gateway重组技术,通过BP和LR两步重组反应将OsAAP6基因序列连接于pDEST32表达载体上。在水稻cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白质。结果筛选到40个可能与OsAAP6蛋白发生相互作用的蛋白。4.通过比对分析,从40个可能发生互作的蛋白中挑选了3个（Pyruvate phosphate dikinase,WRKY,GreA）蛋白,利用酵母体内点对点试验、水稻体内双分子荧光互补试验（BiFC）等试验,进一步验证了PPDK、WRKY和GreA能够分别与OsAAP6蛋白发生相互作用。
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