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干旱胁迫已成为世界性问题,其对作物的危害超过其他逆境危害的总和,因此研究植物耐旱分子机制成为植物基因工程研究的重点。渗调蛋白(Osmotin)是植物细胞膜的组成蛋白,有研究表明OSM在植物对低温和真菌胁迫产生响应,但其对干旱胁迫、尤其是不同OSM同工型对缺水是否产生响应,如何响应等问题知之甚少。 本实验室从马铃薯缺水胁迫消减cDNA文库中,获得了的缺水胁迫响应OSM基因EST,经BLAST检索发现其与膜组成蛋白StOSM-3B99%相似,检索也识别了马铃薯基因组中至少存在11个StOSM基因;本研究明确了11个StOSM编码基因12个染色体上的分布、保守区域以及氨基酸序列的进化关系。 StOSM基因表达定性测定显示,随缺水胁迫加重,StOSM-3F、8E和5A等8个基因mRNA表达量明显增加,其余3个下调表达;表达定量测定表明,在干旱致死零界点(DLP)8个上调表达基因在幼叶的表达量平均高于对照4倍,其中,StOSM-8E mRNA积累量高于对照49倍,该结果与转录组测序计算的RPKM表达量结果一致。 研究分离获得了StOSM-3B的全长cDNA,其中ORF为744bp,推测其编码247个氨基酸组成的渗调蛋白,其与GenBank中记载的StOSM-3B推测的氨基酸存在6处突变;用分离获得的cDNA构建了OSM-3b原核表达载体pET-28c-OSM,将其转化到宿主菌大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,获得了重组菌株BL21-OSM。 在PEG6000浓度梯度渗透胁迫下,重组菌BL21-OSM的菌落存活数统计显示,各浓度下对照菌BL21菌落存活数显著低于重组菌BL21-OSM;2% PEG6000下重组菌的峰值存活数是对照的3倍;在NaCl浓度梯度渗透胁迫下,BL21-OSM菌落存活数显著高于对照菌,1% NaCl下重组菌峰值存活数是对照的2倍。 构建了StOSM抑制和过量表达载体(pCAMBIA1305-OSM-、pCAMBIA1305-OSM),转化StOSM植物体内表达,阳性转化株系StOSM mRNA表达检测和表型观察显示, StOSM抑制转化株系幼苗缺水胁迫寿命明显短于对照,缺水胁迫下StOSM过量转化株系叶片较对照小,但其生长状态明显较对照健康。 体内外表达分析结果表明,缺水诱导膜组成蛋白编码基因StOSM上调表达,响应缺水胁迫;增强StOSM表达可显著增强植物耐旱性。 分离获得的KT启动子的全长DNA序列比对发现,其与GenBank中的耐盐基因(HG975450,Solanum pennellii)的启动子DNA的序列有91%的相似性;将基因MA5置于KT和35S启动子下游,转化马铃薯体内表达,筛选出IAA5过量表达阳性转化株系,表型观察显示,KT启动的IAA5株系株高及叶片较显著大于35S对照。该结果表明,KT启动基因表达能力强于35S启动子。 本研究为马铃薯分子育种提供了新种质。