论文部分内容阅读
背景:慢性肾脏病(chronic kidney diseases,CKD)是一类常见疾病,各种病因的CKD均能导致肾脏功能减退甚至丧失,进展至终末期成为尿毒症。一旦发展成为尿毒症,只能进行透析等肾脏替代治疗以维持生存,患者和家庭会面临沉重的负担。但目前尚无有效的延缓或治疗方法,关键在于防止其发生。肾间质纤维化(renal interstitial fbrosis,RIF)是CKD进展至终末期肾衰竭过程中的共同病理表现,抑制RIF的发生和进展是减缓CKD向终末期肾衰竭进展的关键环节。RIF发生的核心事件是肾间质肾小管周围毛细血管(peritubular capillaries,PTC)损伤导致肾间质血流减少及肌成纤维细胞(myfibroblast,Myo F)增多使大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积。PTC的稳定主要依靠周细胞和内皮细胞共同维持,周细胞损伤影响PTC稳定性,导致肾脏组织缺血导致RIF;肾脏损伤时,周细胞活化产生的细胞因子也促成RIF的形成。另外,ECM沉积于肾间质,使肾脏组织结构破坏及功能丧失导致RIF。Myo F是肾间质中产生ECM最主要的细胞,而周细胞是Myo F的重要来源之一。上述两个核心事件的交汇点是周细胞。因此推测抑制周细胞活化可能是抑制RIF发生和进展的关键靶点。组蛋白巴豆酰化修饰(lysine crotonylation,Kcr)是一种表观遗传学修饰,近年来研究证实Kcr蛋白参与多种细胞活动和生理过程,如调节染色体结构、促进转录和影响性染色体表达等。另外,在许多疾病比如肿瘤、艾滋病、心脏衰竭和器官损伤中也发挥重要作用,尤其在急性肾损伤中发现了Kcr的肾脏保护性作用。但目前尚没有Kcr在CKD发病及进展过程中的变化及作用的研究。目的:探讨Kcr在周细胞活化-RIF中的表达变化规律。方法:体外研究选择了酶消化法提取小鼠肾脏原代细胞,使用血小板源性生长因子受体β(platelet derived growth factor receptorβ,PDGFRβ)标记C57BL/6雄性小鼠肾脏周细胞,利用磁珠分选出周细胞,并对分选后的细胞进行培养。用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激周细胞24、48h,建立体外周细胞活化模型,光镜下观察TGF-β1刺激周细胞24、48h后周细胞形态变化,免疫荧光观察周细胞和Myo F的标记物和Kcr蛋白表达水平的变化,Western blot检测周细胞Kcr蛋白表达水平。体内研究采用C57BL/6雄性小鼠单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)RIF模型,Masson、PAS病理染色观察UUO造模后1、3、7天肾小管扩张程度及RIF程度;免疫荧光检测小鼠肾脏组织中周细胞、Myo F和肾组织中周细胞Kcr表达水平的变化。结果:在体外培养肾脏周细胞活化模型中,光镜下可见TGF-β1刺激后的周细胞形态由伸出多细胞足样突起的胞体变为长梭形,逐渐向类似Myo F的形态变化;PDGFRβ、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)经免疫荧光检测显示随着TGF-β1刺激时间延长,表达均显著增多,与对照组相比有统计学差异(P<0.05);周细胞Kcr蛋白经免疫荧光和Western blot检测显示随着TGF-β1刺激时间延长,表达显著增强,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。在UUO术后RIF小鼠模型中,Masson、PAS病理染色结果显示,UUO术后1天,肾小管上皮细胞出现少量空泡变性;3天肾小管管腔扩张,出现大量空泡变性,伴随上皮细胞脱落,小管间有炎性细胞浸润;7天肾小管结构排列紊乱,大量胶原纤维样物质沉积于肾小球毛细血管腔内和肾间质。PDGFRβ、α-SMA和泛Kcr(pan-Kcr)抗体经免疫荧光检测显示,随着输尿管梗阻时间延长表达显著增多,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。结论:通过体内、体外的实验研究,我们发现在周细胞活化-RIF过程中Kcr表达水平升高。提示周细胞Kcr可能在周细胞活化-RIF过程中发挥重要调控作用,是抑制RIF发生和进展的潜在新干预靶点。Kcr与周细胞活化之间是否有调控作用及其作用机制尚需进一步研究。