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外周动脉疾病(peripheral arterial disease,PAD)是一种常见的发生在外周血管、尤其是下肢动脉的血流障碍性疾病。下肢PAD症状多样,严重影响患者生存质量[1]。PAD标志着患者体内动脉粥样硬化性疾病状态的存在,并且与增加心脑血管疾病死亡率的诸多诱因相关。 经典的下肢PAD疗法包括经皮腔内血管成形术(percutaneous transluminalangioplasty, PTA)、血管架桥手术(bypass)等,然而由于这些疗法局限性,仍使许多患者最终不得不接受截肢手术。有人开始采用干细胞移植、基因导入等治疗性血管新生(Therapeutic Angiogenesis)疗法来重建缺血组织的血运。生物体内天然存在的血管生成相关的细胞因子是该疗法的理论基础。 环糊精是一类环状低聚糖,其拥有亲水外围和疏水核心的结构可以选择性的包络疏水物质,提高包络物质的水溶性,被人们广泛用于有机物合成、分离等过程,可以作为医用辅料与食品添加剂等。体外实验证明环糊精具有一定的促血管新生作用[9]。本研究通过每日局部肌注(2-羟丙基)-β-环糊精((2-Hydroxypropyl)-beta-cyclodextrin)以研究其对兔后肢缺血模型血管新生的作用。 材料与方法: 一、动物分组、给药方式及后肢缺血模型建立 20只新西兰大白兔,体重(2.30±0.18kg),雄性,随机分为4组,每组5只,B、C、D组采用浓度分别为10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L的(2-羟丙基)-β-环糊精肌肉注射,A组采用磷酸缓冲液作为对照。包括对照组给药方式为肌肉注射,注射点为左侧大腿中部4面各1针,小腿前后各1针,共计6针,每针注射0.1ml,注射时间为股动脉结扎切除术后第7天至27天,共计21天。股动脉结扎术采用大腿部正中与股骨长轴一致的直线切口,近端结扎点为股动脉分出旋股外侧动脉之后,结扎后切除结扎点间股动脉。 二、经耳廓后动脉后肢动脉数字减影血管造影 观察侧支循环建立采用经耳廓后动脉后肢动脉数字减影血管造影,各组均在术后第28天取材前进行造影检查。选取右侧耳廓后动脉以18G动脉穿刺针穿刺耳廓后动脉喷血后,0.014-inch微导丝透视下继续轻柔并快速送入导丝至右颈总动脉,引入1.8F微导管,透视下与导丝相互配合进入左侧下肢动脉,导管头留置于髂内、外动脉分叉前进行造影。动态观察造影图像,计数侧支血管数量。 三、免疫组织化学分析 股动脉造影随访后处死动物,留取大腿半膜肌。标本OCT包埋,切成8μm厚连续肌肉横断面切片。CD31鼠抗人单克隆抗体标记内皮细胞。随机选取10个200×放大视野,计数阳性染色肌肉毛细血管密度(/mm2)和血管/肌纤维比值。 四、统计学分析 所得数据以均数±标准差形式表示,应用GraphPadPrism5.0软件对各组数据进行单因素方差分析和重复测量单因素方差分析。当P<0.05时,认为结果具有统计学意义。 结果: 1、血管造影随访计数侧支血管数量 到术后第28天,各组均形成侧支循环,造影结果显示A~D组形成侧支血管数分别为3.60±1.41、4.20±1.48、6.80±1.79和5.20±1.48,单因素方差分析显示(2-羟丙基)-β-环糊精对侧支循环建立具有影响(P<0.05)。与A组相比,C组侧支血管数量明显增多(P<0.01),B、D组增高不明显(P>0.05)。 2、CD31免疫组化染色计数肌肉毛细血管密度和血管/肌纤维比值 免疫组化染色显示A~D组毛细血管密度分别为89.29±8.56、103.50±17.67、127.80±25.40和112.80±22.38/mm2,血管/肌纤维数比值分别为0.503±0.077、0.521±0.114、0.676±0.031和0.557±0.098,单因素方差分析显示(2-羟丙基)-β-环糊精对肌肉毛细血管密度和血管/肌纤维比值有影响(P<0.05)。与A组相比,C组的毛细血管密度和血管/肌纤维比值明显增长(P<0.05),B组和D组增加不明显(P>0.05)。 结论: 1、每日给予10-8M(2-羟丙基)-β-环糊精可促进兔后肢缺血模型侧支循环建立。 2、每日给予10-8M(2-羟丙基)-β-环糊精可促进兔后肢缺血模型CD31阳性表达的微血管密度及血管肌纤维比值提高。