急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种血液系统恶性肿瘤,其主要特点是生长迅速、凋亡失调、以及白血病细胞分化障碍。目前常用的治疗方法副作用严重、耐药性强、耐受性差,且患者总体预后较差,因此迫切需要研究开发新颖的治疗方式。我们之前的研究表明,4-氨基-2-三氟甲基-苯基视黄酸酯（ATPR）是全反式视黄酸的（ATRA）新型衍生物,是我们课题组在ATRA的基础上进行结构改造而来的。经体外药效学研究发现,ATPR可以诱导急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）细胞分化和周期停滞,而且对非APL的其他AML型细胞也有药物作用。我们前期研究发现,ATPR具有药效长、溶解度高、毒性低等优点,而且体外抗肿瘤活性测定结果显示:ATPR对白血病、肺腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞均有明显的治疗效应。本课题组前期众多研究显示其抗肿瘤的分子机制是通过影响酶活性、蛋白的相互作用、非编码RNA对下游的调控等,但还有许多其他作用机制有待近一步研究。转录因子E2A,又名TCF3（Transcription Factor-3）为BHLH家族成员之一,位于细胞核,调控细胞增殖、分化等相关基因的表达。E2A基因编码蛋白E12和E47,其BHLH结构域介导二聚化并与DNA中的E-box基序结合,AD1和AD2结构域协同招募p300和GCN5,促进靶基因的激活。E2A也被称为早期B细胞发育的调控因子,在多种人类的癌症中都存在异常表达,与细胞分化、增殖、转移以及预后不良有着密切的关联。近期一些研究表明:E2A位点是不同白血病常见的染色体重排的共同靶点,导致E2A嵌合白血病癌蛋白形成,例如:E2A-Pbx1,E2A-HLF等,然而其易位导致白血病的确切机制尚未阐明。综上所述,提示E2A基因的异常改变可能在白血病的发病机制中发挥着关键的作用。早期预实验结果显示:ATPR明显抑制AML细胞中E2A的蛋白和m RNA的表达水平,因此本文将进一步明确E2A基因在ATPR诱导的AML细胞分化和周期阻滞过程中的作用并探讨其可能存在的分子机制,为研究新药ATPR提供一定的理论基础。目的:本文重点研究E2A基因在ATPR作用后,AML细胞分化和周期阻滞中的效应的相关的作用机制。方法:1.ATPR处理后AML细胞后E2A基因的表达情况使用Western blot检测健康受试者、AML患者血液样本、不同AML细胞株中E2A基因与正常对照的表达情况。我们体外培养AML细胞株NB4与THP-1细胞,Western blot、q-PCR检测ATPR不同浓度和不同时间下E2A基因蛋白和m RNA水平的变化情况。采用Western blot检测ATPR在最佳作用浓度和时间(10-6 M,72 h)下与阳性对照药物ATRA(10-5M,72 h)相比,E2A基因表达水平变化。2.E2A基因的敲除或过度表达对ATPR诱导AML细胞分化和周期阻滞的影响我们在AML细胞中转染了sh-E2A慢病毒降低E2A基因的表达活性或者LV-h-E2A慢病毒升高E2A表达水平,在ATPR(10-6 M)给药处理3天后。对于各个实验处理组,通过使用Western blot和流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）测定细胞表面分化抗原CD11b和CD14的阳性分化相对比例;瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学;NBT还原实验计算阳性细胞分化百分率;Western blot检测细胞周期相关蛋白表达水平的变化;FCM检测细胞周期G0/G1期,S期,G2期的分布情况。3.转录组基因测序（RNA-seq）分析E2A基因在AML的作用影响我们收集实验分组的细胞,送至测序实验机构进行后续的实验操作。4.E2A基因对ATPR处理的AML细胞中c-Myc和P-53表达的影响采用Western blot检测健康受试者、AML患者血液样本、不同AML细胞株中c-Myc和P-53基因与正常对照的表达情况。通过免疫共沉淀（Co-IP）检测E2A基因在AML细胞中与c-Myc基因的作用;免疫荧光双染技术观察E2A基因和c-Myc基因在AML细胞的分布情况;采用Western blot检测E2A基因的敲除或过度表达对c-Myc和P-53的表达变化情况;采用Western blotting检测ATPR在最佳作用浓度和时间(10-6 M,72 h)下与阳性对照药物ATRA(10-5 M,72 h)相比,c-Myc和P-53基因蛋白表达水平变化。5.E2A基因的敲除对体内肿瘤的影响首先构建NSG异种移植瘤小鼠模型,检测E2A基因表达下调对体内肿瘤生长发育的影响,再经Western blot和免疫组化检测皮下肿瘤组织中细胞分化和周期阻滞相关蛋白的表达水平。结果:1.E2A基因在AML患者及其细胞株中,与正常对照组相比高度表达。在AML细胞株NB4与THP-1细胞中,ATPR以时间和浓度依赖性抑制E2A基因的蛋白和m RNA的表达水平。与对照组相比,ATPR和ATRA均对AML细胞中E2A基因的活性有抑制作用。2.E2A基因的表达活性降低增强ATPR对AML细胞的诱导分化和周期阻滞的治疗效应,而过度表达E2A基因则逆转了ATPR的治疗作用。3.我们进行了细胞转录组基因测序,根据测序结果,通过生物信息学预测和微阵列结果建立一个E2A基因共表达网络,发现与差异表达的E2A基因的关键下游因子是c-Myc基因以及密切相关P-53信号通路。4.E2A基因的沉默可以抑制c-Myc基因的表达,激活P-53信号通路,而过度表达E2A逆转了上述现象。E2A基因和c-Myc基因共同定位于AML的细胞核中,而且两者存在相互作用。ATPR抑制E2A/c-Myc基因的表达,激活P53信号通路。5.与对照组相比,沉默E2A基因组:移植瘤体积和瘤重均显著减小,细胞分化蛋白表达水平升高,且抑制细胞周期蛋白的表达,与体外细胞实验结果一致。结论:ATPR作用于AML细胞,抑制细胞中E2A的表达,进而降低下游c-Myc基因的表达,激活P-53信号通路,诱导AML细胞分化与周期阻滞。