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在DNA纳米技术中快速发展起来的核酸适配体能以高亲和力和高选择性与受体结合,并以其优良的性质在生物医学领域具有很大的应用价值。在生物体中,蛋白质是生命信息表达的物质载体,几乎所有的生物过程都与蛋白质的调控密切相关。核酸适配体能够特异性识别相关蛋白从而直接或者间接调控蛋白的功能,对于蛋白质的活性调控具有很好的研究价值。凝血级联反应中的相关蛋白凝血酶是适配体研究中较早用到的一种受体,现有的适配体主要是经过指数富集配体系统进化技术（SELEX技术）进行筛选,或在已有的单价适配体基础上改进得到具有更高亲和力的二价或者多价适配体。但是目前结合凝血酶的单价适配体亲和力较低,二价适配体设计时有些忽略了分子中适配体之间的连接刚性、距离及空间取向,造成结合时焓或熵的损失,这样会影响与受体的结合能力。本项研究考虑以上因素,探索多价适配体的设计原则,设计一种亲和力高的刚性二价适配体的结构。目的:1.探索二价适配体设计时分子连接刚性、距离及空间取向的影响,综合这些因素合理设计一种与凝血酶结合亲和力更高的刚性二价适配体。2.将本文的设计原则用于研究与更多受体结合的多价适配体。3.探索多价适配体与蛋白质的相互作用,组装DNA-蛋白质离散结构聚合物,可以将其应用于蛋白抑制剂或其他生物纳米材料的研究。方法:1.根据凝血酶与常用的单价适配体TBA15和TBA29的晶体结构基础上,综合考虑文献中已有的二价适配体设计时遵循的方法与不足,使用刚性DNA双链连接这两种单价适配体发挥协同作用,并在刚性连接转角处加入柔性的单链环,使之形成具有左臂/中间桥/右臂的刚性二价适配体1#（0/0/0A4）。在此二价适配体的结构上,研究两个单价适配体之间分子连接刚性、距离及空间取向与凝血酶作用的关系,采用非变性凝胶电泳（native PAGE）观察单价适配体TBA15和TBA29、柔性二价适配体TBA-4及各个刚性二价适配体与凝血酶结合后迁移率及结合率的变化,初步判断与凝血酶的结合效果。2.使用原子力显微镜（AFM）表征native PAGE中二价适配体与凝血酶的迁移条带代表的聚合物构象,判断聚合物结构与两个单价适配体间的分子连接刚性、距离及空间取向的关系。3.使用等温滴定量热法（ITC）测定并计算适配体与凝血酶结合的亲和力（Kd值）,比较各个适配体与凝血酶的结合能力并判断设计的二价适配体的结合效果。4.凝血酶通过使可溶性的纤维蛋白原转化为不溶性的纤维蛋白来引发凝血反应,使用实时光散射监测适配体和凝血酶在纤维蛋白原溶液中荧光信号的变化,在体外研究适配体抑制凝血酶的能力。5.去除柔性的单链环提高二价适配体的刚性,构建更为复杂的适配体-凝血酶离散结构聚合物,通过native PAGE和AFM来研究中间连接链双链螺旋长度对于形成适配体-凝血酶聚合物构象的影响。结果:1.Native PAGE结果表明,与单价适配体TBA15和TBA29、柔性二价适配体TBA-4及SELEX技术筛选得到的刚性二价适配体TBV-08比较,本论文设计的刚性二价适配体1#（0/0/0A4）与凝血酶的结合率有了明显的提升,并且在对此刚性二价适配体结构进行研究发现右臂与中间连接链角度较大、左臂或右臂较长时,适配体与凝血酶结合物的迁移率降低,说明设计的适配体由于结构的差异与凝血酶可形成不同的聚合物。2.AFM结果表明,柔性二价适配体TBA-4与凝血酶形成三聚体,刚性二价适配体TBV-08与凝血酶形成单聚体及少量二聚体,设计的1#（0/0/0A4）中两个适配体之间的距离与凝血酶上的两个位点距离相差不大而与凝血酶形成单聚体,而右臂与中间连接链角度较大、左臂或者是右臂较长时,引起两个适配体之间的距离大于凝血酶上的两个位点距离而形成的二聚体会更加稳定。3.从ITC的结果可看出,与对照组相比较设计的二价适配体的亲和力有了提升,解离常数Kd值由大到小排列为TBA15＞TBA29＞TBA-4＞TBV-08＞9#（0/2/0A4）＞1#（0/0/0A4）。4.实时光散射实验的荧光信号变化显示,设计的1#和9#适配体的抑制凝血酶活性的效果最好,其次为TBV-08、TBA-4,单价适配体TBA15和TBA29抑制凝血酶活性的效果最弱。5.Native PAGE中适配体与凝血酶的条带与AFM结果显示,刚性更强的适配体会形成更复杂的适配体-凝血酶离散结构聚合物,结合物构型从三聚体到六聚体之间变化,与中间连接链双链螺旋长度有关。结论:本研究提出了二价适配体设计时提高亲和力的原则:（1）提高分子刚性,适配体和受体结合时具有最小的熵损失;（2）适配体与凝血酶结合时考虑最适当的空间距离及方向。这些原则也可用于指导不同受体的多价适配体的结构设计。使用凝血酶作为研究的受体,展示了二价适配体对于凝血酶更高的亲和力和抑制活性。多价相互作用的适配体可以提高蛋白质的局部浓度,增强与蛋白质的结合能力。通过研究多价适配体与凝血酶的结合方式,组装不同结构DNA-蛋白质离散结构的聚合物,推动蛋白抑制剂及其他生物纳米材料的发展。