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目的:建立一种简便、可靠的Sprague-Dawley(SD)大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)体外分离培养的方法。方法:单纯贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,倒置显微镜观察细胞生长形态,噻唑蓝(MTT)法测定细胞生长曲线,免疫组化法检测骨髓间充质干细胞标志抗原CD90、CD44和造血干细胞标志抗原CD45的表达情况。结果:培养的BMSCs为多角形或梭形,大小均一,呈漩涡状排列生长。免疫组化检测显示培养细胞高表达BMSCs干细胞标志抗原CD90、CD44,而不表达造血干细胞标志抗原CD45.结论:单纯贴壁法可有效分离、培养和纯化大鼠BMSCs,为其组织工程的临床研究应用提供了实验基础。第二部分SD大鼠试验性巨结肠模型的建立和鉴定目的:建立一种大鼠巨结肠实验动物模型,为临床开展干细胞移植提供实验基础。方法: 200±15g重SD大鼠110只,随机分为两组。模型组用5 mL/L-1的苯扎氯铵(BAC)经肛处理大鼠结肠45min,对照组用生理盐水。于术后1、2、4、8周行大体观察、结肠测压、取处理段结肠行HE染色、神经元特异性烯醇化酶(neural specific enolase,NSE)和蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)免疫荧光染色以及乙酰胆碱酯酶(AchE)组织化学染色观察,RT - PCR检测AchE、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、神经营养素3(Neurotrophin-3,NT-3)的表达情况。结果:术后一周实验组大鼠逐渐出现腹胀,排便减少,解剖发现处理段肠管痉挛狭窄,上端肠管肠内容物潴留,反射性收缩消失,组织学检查显示肠神经节细胞消失,且Real-Time PCR也证明AchE、GDNF、NT-3的表达明显下调。对照组则无明显改变。结论:经肛应用5 mL/L-1BAC的方法成功建立了无神经节细胞肠段的大鼠实验模型,且该模型稳定、可靠、重复性好,为深入研究先天性巨结肠的病理生理提供了一个可靠的模型基础。第三部分GDNF和FNT-3双基因真核表达载体的构建目的:构建GDNF和NT-3双基因共表达的真核表达载体。方法:从新生大鼠脑组织中采用逆转录PCR方法扩增GDNF和NT-3基因序列,将扩增产物分别克隆到pEGFP-N1载体,然后双酶切各pEGFP-N1载体,回收目的基因片段,将目的基因片段克隆至真核表达质粒pEGFP-N1中,构建其真核表达载体pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3,并对重组体进行酶切及测序鉴定。结果:PCR扩增片段与预期结果一致,GDNF-NT-3共表达载体构建成功,双酶切和测序结果正确。结论:成功构建了pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3双基因共表达真核表达质粒载体。第四部分pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3真核表达载体在大鼠骨髓间充质干细胞的表达及成神经诱导目的:探讨重组体pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3双基因表达载体转染大鼠间充质干细胞后的表达以及诱导分化为神经细胞的可行性。方法:全骨髓法分离培养BMSCs,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞标志CD90和造血干细胞标志CD45。转染带荧光的GDNF和NT-3基因,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及细胞的形态变化;免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和神经胶质酸性蛋白(GFAP)的表达;Western blot检测细胞GDNF及NT-3蛋白表达。对照组为未转染GDNF和NT-3基因的BMSCs。结果:BMSCs能在体外成功分离培养,细胞高表达CD90 ( 92.7% ) ,不表达CD45。诱导分化后,BMSCs胞体变圆,伸出明显突起,并可见多数细胞相互交织成网状结构,呈神经细胞样形态。免疫荧光标记检测可见实验组细胞表达NSE和NF,而不表达GFAP。而对照组阴性。Western blot检测可见细胞GDNF及NT-3蛋白表达增强。结论:研究表明重组质粒pEGFP-EGFP-GDNF-NT-3转染后可在BMSCs中成功表达,转染重组质粒后的BMSCs可分化为神经样细胞并表达神经元标志。该研究为基因治疗神经系统疾病提供了实验基础第五部分共表达GDNF和NT-3基因的大鼠骨髓间充质干细胞向肠神经样细胞分化的研究目的:初步研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导分化为肠神经样细胞以治疗先天性巨结肠的可行性。方法:体外分离培养BMSCs,流式细胞术方法检测CD90和CD45的表达,传代至第五代进行诱导分化。实验组采用NanoJuice?转染试剂将目的基因胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和神经营养素3(NT-3)共转染至BMSCs内,并联合胎肠培养基(fetal gut culture medium,FGCM)诱导,设阳性对照组(单纯转染pEGFP-GDNF-NT-3)和阴性对照组(未转染质粒的BMSCs),免疫荧光显微镜观察转染及表达情况,免疫荧光鉴定细胞的神经特异性烯醇化酶(neural specific enolase,NSE)、蛋白基因产物9.5(Protein gene production 9.5,PGP9.5)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、一氧化氮合酶(nitric oxidesynthase,nNOS)及神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达,RT- PCR检测目的基因表达情况。结果:体外成功培养及纯化BMSCs,流式细胞术检测高表达骨髓间充质干细胞标志CD90,而不表达造血干细胞标志CD45。转染后24h即可在免疫荧光显微镜下观察到GFP表达,G418筛选4周后,细胞形态呈神经元样改变,免疫荧光实验组可见NSE、PGP9.5、VIP及nNOS阳性表达, GFAP阴性,阳性对照组亦有NSE阳性表达,而PGP9.5、VIP、nNOS及GFAP阴性,两组的阳性率有统计学差异,阴性对照组未见表达。RT- PCR显示目的基因在BMSCs内成功表达。结论: GDNF和NT-3双基因修饰联合FGCM诱导的BMSCs可分化为肠神经细胞并表达肠神经标志,为相关肠神经系统疾病如先天性巨结肠的基因治疗提供了实验基础。第六部分双基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗实验性巨结肠的初步研究目的:研究GDNF和NT-3双基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞移植实验性巨结肠大鼠模型肠壁的存活和基因表达情况,探讨双基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗实验性巨结肠的可行性。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并采用共表达胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3基因的真核表达载体转染修饰骨髓间充质干细胞。将双基因修饰的细胞移植入实验性巨结肠模型鼠去神经支配肠段肠壁。分别于术后1、2、4、8周行大体观察、病理学检测、免疫荧光检测PGP9.5、VIP的表达;real-time PCR检测GDNF、NT-3及RET mRNA的表达情况结果:1.采用贴壁法成功分离培养和纯化了骨髓间充质干细胞。2.通过基因修饰骨髓间充质干细胞可诱导分化为肠神经样细胞。3.运用0.5%BAC处理大鼠结肠后一周,病理学检查可见神经节细胞缺失。骨髓间充质干细胞移植后1、2、4周后免疫荧光检测可见PGP9.5、VIP阳性的神经节细胞,而PBS移植组未见阳性表达。同时,与PBS移植组相比,干细胞移植组RET, GDNF and NT-3 mRNA的表达逐渐增加。结论:双基因修饰的骨髓间充质干细胞可以在实验性巨结肠大鼠模型肠壁定植存活并表达相关基因,部分恢复结肠神经肌肉调节功能,为细胞移植治疗先天性巨结肠提供了实验基础。