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吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)，是一种新型辅酶，利用微生物产PQQ是目前研究的热点也是难点，本论文以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌(E. coli BL21)为宿主菌，采用诱变和分子生物学的方法，从以下几个方面筛选和构建了PQQ的高产菌，并确定了PQQ的高效液相色谱(HPLC)法检测PQQ的条件。1、本论文以K. pneumoniae为出发菌株，采用紫外诱变、氯化锂诱变、以及二者复合诱变，然后用非酶法检测PQQ产量，所得3株菌U1，U2和L1的PQQ产量较高且遗传稳定，分别是出发菌株的6倍、2.7倍和5倍。利用紫外线-氯化锂进行复合诱变得到一株是出发菌株产量1.4倍的菌株。2、本论文对PQQ的HPLC检测条件进行了探索，综合PQQ的特殊结构及文献报道，通过不同波长、不同流速时PQQ吸收峰的对比，最终确定了最佳检测条件为以水和甲醇、磷酸为流动相(体积比为95%:5%:5‰)，流速0.8ml/min，波长200nm。同时以不同浓度的PQQ标准品绘制了PQQ浓度的标准曲线，R2达到0.9936。3、本论文首次从PQQ的分泌表达方面入手，通过克隆大肠杆菌中的孔蛋白OmpA，phoE，与含卡那霉素启动子的pET-28a-kan相连，同时根据不同抗性的质粒可以在同一菌株中共存，克隆氯霉素抗性基因替换载体上的卡那抗性基因。得到PQQ产量最高为双质粒工程菌K. p(pET-kan-pqq, pET-kan-phoE-Cm)，最高为224.82mg/L，比原始菌株K. p提高了116.65%，为PQQ分泌表达奠定了基础。4、本论文克隆了pET-22b载体上的信号肽序列，将其连接到载体pET-28a-pqq上的T7启动子之后，pqq基因簇之前，对构建好的工程菌E. coli BL21(pET-28a-pelb-pqq)进行发酵，PQQ最大产量达到40.73mg/L，比对照菌E. coliBL21(pET-28a-pqq)提高了20.68%，说明信号肽的表达促进了PQQ的分泌，提高了PQQ的产量。5、本论文利用不同抗性构建了同时含有表达载体pET-28a-pqq和pET-22b-gcd的双质粒工程菌E. coli BL21(pET-28a-pqq, pET-22b-gcd)，48h后90%的细胞能同时含有两个质粒，双质粒工程菌的PQQ产量最高可达199.8mg/L，是对照菌E. coli BL21(pET-28a-pqq)的4倍，且该工程菌的生长速度比单质粒的工程菌快，其葡萄糖利用率也明显提高，为PQQ和葡萄糖脱氢酶的耦合代谢途径的进一步研究奠定了基础。