【摘 要】
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毛色和肤色是动物重要的外在特征,它的形成与黑色素细胞的活动密切相关,黑色素细胞生成的黑色素类型（真黑色素和褐黑色素）及其相对含量决定了动物毛色和肤色。目前研究多集中在基因调控动物毛发和皮肤黑色素生成上,挖掘了与动物毛色和肤色形成密切相关的候选基因。但由于物种特异性,山羊毛色和肤色形成的调控机制还不明晰。miRNA是一类内源性、单链小分子RNA,通过与靶基因相互作用,影响基因的转录后表达,调控黑色素
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31772564）； 重庆市自然科学基金重点项目（cstc2020jcyj-zdxmX0015）； 重庆市现代山地特色高效农业产业技术体系（草食牲畜）（2020【11】号）； 重庆市科企联合体种质资源收集利用与品种试验项目资助(草食牲畜)；
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毛色和肤色是动物重要的外在特征,它的形成与黑色素细胞的活动密切相关,黑色素细胞生成的黑色素类型（真黑色素和褐黑色素）及其相对含量决定了动物毛色和肤色。目前研究多集中在基因调控动物毛发和皮肤黑色素生成上,挖掘了与动物毛色和肤色形成密切相关的候选基因。但由于物种特异性,山羊毛色和肤色形成的调控机制还不明晰。miRNA是一类内源性、单链小分子RNA,通过与靶基因相互作用,影响基因的转录后表达,调控黑色素细胞黑色素的生成。本课题组前期通过对乌皮和白皮山羊进行小RNA测序,筛选到一批在不同颜色皮肤中差异表达的miRNAs,并初步筛选了miR-129-5p作为调控山羊皮肤黑色素生成的候选分子。但miR-129-5p及黑色素生成相关基因在山羊各组织中的表达规律,以及miR-129-5p是否参与调控皮肤黑色素生成还不确定,需要进一步研究。本研究采集了大足黑山羊（Dazu black goat,DBG）羔羊（0d）、成年羊和内蒙古绒山羊（Inner Mongolia Cashmere goat,IMCG）成年羊的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮肤组织样品。先检测了不同类型山羊皮肤中黑色素的含量,随后检测了miR-129-5p及黑色素生成相关基因在各组织中的表达情况。之后以黑色素生成调控研究中广泛使用的B16-F10皮肤黑色素瘤细胞系为实验材料,进行细胞诱导分化实验,探究分化过程中细胞形态、黑色素生成相关基因表达量以及黑色素含量的变化。随后瞬时转染miR-129-5p的模拟物和抑制物（miR-129-5p mimics、miR-129-5p inhibitor）,探究miR-129-5p对黑色素生成相关基因的表达以及细胞黑色素的生成的影响。主要的研究结果如下:1.0d DBG皮肤中的黑色素含量显著高于成年DBG和IMCG（P<0.05）;成年DBG皮肤黑色素含量高于IMCG,但差异不显著。2.利用qRT-PCR实验检测发现,miR-129-5p和黑色素生成相关基因TYR、MITF、TYRP1、TYRP2和MC1R在不同毛色山羊心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮肤等组织中均有表达。0d DBG皮肤中miR-129-5p,TYRP1和TYRP2基因的表达量显著高于成年DBG和IMCG（P<0.05）。在皮肤组织中,0d DBG TYR基因表达量显著高于IMCG（P<0.05）。3.通过分化培养基培养,诱导B16-F10细胞分化,定期拍照记录细胞形态变化,并分别检测黑色素生成相关基因m RNA表达量、蛋白表达量以及黑色素含量的变化。研究发现,B16-F10细胞随着分化时间的增加,细胞树突数量增加,长度增长,并相互交织成网,胞体黑色素颗粒增多,透光性下降,黑色素含量逐渐增加。黑色素生成相关基因TYR、TYRP1、TYRP2表达量随着分化时间的增加而升高,TYR蛋白、TYRP1蛋白、MITF蛋白表达量也随着分化时间的增加而升高。4.设置不同时间梯度转染组,利用qRT-PCR技术检测miR-129-5p表达量,筛选出最佳转染时间。在最佳转染时间下,转染miR-129-5p mimics后miR-129-5p表达量显著上调2000多倍（P<0.05）,此时TYR的表达量比NC组提高了57.3%差异显著（P<0.05）;而减低表达miR-129-5p后,TYR的表达量比对照组降低了38.9%差异显著（P<0.05）。在蛋白水平上,过表达miR-129-5p后,TYR蛋白的表达量比NC组提高了49.2%差异显著（P<0.05）;而减低表达miR-129-5p后,TYR蛋白的表达量降低了21.1%差异显著（P<0.05）。5.转染后,黑色素细胞沉淀显著变黑,通过Na OH比色法检测,过表达组黑色素含量比NC组提高了18.3%,差异显著（P<0.05）。结论:1.0d DBG皮肤中的黑色素含量显著高于成年DBG和IMCG（P<0.05）。2.miR-129-5p在山羊心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮肤中均有表达,皮肤组织中0d DBG的表达量显著高于成年DBG和IMCG（P<0.05）,暗示miR-129-5p在幼年个体皮肤黑色素生成中有重要作用。3.皮肤组织中,0d DBG TYR基因表达量显著高于IMCG（P<0.05）,TYRP1和TYRP2基因表达量显著高于成年DBG和IMCG（P<0.05）。4.B16-F10细胞系随着分化时间的增加,树突明显变多变长,黑色素生成相关基因表达量上调,蛋白表达量增加,黑色素颗粒增多,透光性下降,黑色素含量逐渐增加。5.miR-129-5p可以促进细胞中TYR和TYRP1的表达,进而促进细胞黑色素的生成,miR-129-5p可能是山羊皮肤黑色素生成的重要调控分子。
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