肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是全球常见第六位肿瘤，并位于肿瘤死因的第三位。我国是原发性肝癌发病率较高的国家，每年新发肝癌的病例数占世界发病数的54％，位于肿瘤死因的第二位。虽然以手术为主的新型治疗手段出现，使得肝癌生存率有了较大的提高，但是超过60％的患者在术后5年有复发可能，较高的复发率成为提高患者总体生存的主要障碍。随着人类基因组学研究的发展和基因芯片与蛋白质芯片技术的产生，高通量基因和蛋白质分析成为了可能，对不同肝癌患者的分子特征的认识逐渐深入，基于分子分型基础之上的临床病理分子分型和分期系统可使肝癌患者细分为众多的亚群，在这一基础之上传统的手术、化疗、放疗、免疫治疗、生物治疗和新的分子靶向治疗等均可按照肝癌患者的个体化特征采用完全个体化的高效的精准治疗手段，分子分型可给靶向治疗提供更多的靶点。因此，寻找肝癌转移相关的生物标志物，开展肝癌的新型分子靶向治疗，以期达到较高的疗效，是当前研究的热点。　　恶性肿瘤内出现的严重的急慢性缺氧，葡萄糖的摄取和无氧糖酵解增加，造成肿瘤细胞恶性转化、侵袭转移和对放化疗等治疗抵抗，使目前的治疗方法难以达到理想的效果，为肿瘤的治疗带来了难题，同时也带来探索肿瘤治疗的切入点。靶向细胞的生化代谢中的糖酵解途径已逐渐成为癌症诊断及治疗的关键，结合FDG-PET分子显像为肿瘤的早期诊断与鉴别诊断、肿瘤内缺氧程度的评价、治疗前后效果的评估和预后的判断开辟新的前景。　　乳酸脱氢酶(LactateDehydrogenase，LDH)广泛存在于人体的各个组织中，主要催化糖酵解途径的终产物丙酮酸和乳酸之间的相互转化。乳酸脱氢酶按照组成亚基(M型、H型)的差异分为5种同工酶。乳酸脱氢酶-A(LactateDehydrogenase-A，LDHA)属于乳酸脱氢酶家族同工酶之一，全部由M型亚基组成，正常情况下主要分布在肌肉组织中。LDHA主要功能是催化丙酮酸向乳酸转化，同时将NADH转化成NAD+。LDHA基因的突变在人体除可导致运动型肌红蛋白尿之外，对人体影响不大。近年来研究发现LDHA在各种实体肿瘤组织中异常表达，且和肿瘤的分化及患者的预后具有重要的关系，可能是一个有效的治疗靶点。然而，LDHA对肝癌生长的影响，特别是对肝癌侵袭和转移的影响至今仍不十分清楚。本论文研究不同转移潜能人肝癌细胞系及人肝癌组织中LDHA表达情况，分析LDHA表达与肝癌侵袭和转移之间的关系;采用慢病毒为载体的RNA干扰技术，研究靶向LDHA基因的治疗策略在体内外对肝癌细胞生长及侵袭转移的抑制作用，为LDHA作为靶点的肝癌基因治疗提供基础数据;利用基因表达谱差异芯片筛选LDHA抑制前后差异表达基因和信号通路，揭示LDHA影响肝癌细胞生长和转移的可能分子机制。　　第一部分:LDHA在肝癌细胞系及肝癌组织中的表达　　研究不同转移潜能人肝癌细胞系及人肝癌组织中LDHA表达情况，分析LDHA表达与肝癌侵袭和转移之间的关系。分别应用Real-timePCR，WesternBlot和生化速率法检测正常肝细胞系L-02和5种不同转移潜能人肝癌细胞系Hep3B、HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3细胞LDHA的表达和乳酸脱氢酶活性水平;收集62例原发性肝癌组织芯片，其中47例无肝内转移，15例有肝内转移，用免疫组织化学方法检测LDHA表达情况。Real-timePCR结果表明，在mRNA水平具有相同遗传背景的不同转移潜能肝癌细胞系随侵袭转移潜能增高，LDHA的表达也依次增高，HCCLM3细胞LDHAmRNA表达水平最高，WesternBlot的结果与Real-timePCR结果一致。转移潜能高的细胞系细胞胞内和细胞培养上清中LDH活性均显著高于转移潜能较低的细胞系。免疫组化结果显示:在肝癌组织中LDHA为胞浆内表达，部分有核内表达，62例肝癌组织中LDHA表达均为阳性，定量分析结果表明LDHA的表达水平在有肝内转移组显著强于无肝内转移组。以上结果表明:LDHA在肝癌细胞株和人类原发性肝细胞癌中高表达，且与肝癌侵袭和转移等恶性生物学行为有关，LDHA基因高表达可作为判断HCC侵袭性和进展的一个重要指标。　　第二部分:LDHA基因RNAi体外及体内实验研究　　为进一步研究LDHA对肝癌细胞生长和侵袭转移能力的影响，通过靶向LDHA基因的RNA干扰技术抑制LDHA表达，观察高转移潜能人肝癌细胞系HCCLM3生长、侵袭能力以及裸鼠移植瘤肿瘤生长及转移等生物学行为的改变，探索靶向LDHARNAi对肝癌生长和转移的治疗作用。首先设计、合成LDHAsiRNA，瞬时转染HCCLM3细胞，Real-timePCR和WesternBlot检测干扰效果。筛选出干扰效率较高靶点用于合成shRNA，构建LDHAshRNALenti.干扰质粒。重组质粒转染HCCLM3细胞，Real-timePCR，WesternBlot和生化LDH酶活性检测验证干扰效果，筛选出干扰效率较高的shRNA重组质粒进行后续体外和体内实验研究。应用CCK8、体外侵袭实验观察细胞增殖和侵袭能力的改变。裸鼠原位移植瘤实验观察LDHA干扰病毒对肝癌生长、转移和裸鼠生存期的影响。结果表明:针对LDHA基因的LDHAsiRNALenti.重组病毒转染HCCLM3细胞48h后，Real-timePCR和WesternBlot结果显示LDHA基因表达水平下降92.8％，蛋白质表达水平下降66.8％。在0.4μg/mLpuromycin选择性培养3周后，得到LDHA低表达的稳定克隆细胞株，经验证LDHAmRNA抑制率大于73.3％，蛋白质水平和LDH酶活性水平分别下降56.2％和63.2％。体外增殖实验结果显示:转染了LDHAshRNALenti.后，HCCLM3细胞增殖能力明显降低，细胞倍增时间由原来的39.52h增至54.39h，延长了17.8h。侵袭能力明显降低，与PBS组和对照重组病毒组（ControlshRNALenti.）相比两者差异有显著性。裸鼠实验表明，LDHAshRNALenti.组肿瘤瘤体重(1.43g±0.20g)低于ControlshRNALenti.组(2.19g±0.37g，P＜0.01)和PBS组(2.34g±0.55g，P＜0.01)。ControlshRNALenti.组和PBS组裸鼠发生肺转移率分别为71.4％和75％，而LDHAshRNALenti.组只有1只(1/10，10％)裸鼠发生肺转移，肝癌的肺转移发生率显著下降。LDHAshRNALenti.组荷瘤裸鼠的生存期为141.2d±6.80d，与ControlshRNALenti.组(91.83d±12.87d)和PBS组(95.6d±5.81d)相比差异显著(P＜0.01)。以上结果表明:LDHA基因下调后肝癌细胞侵袭潜能下降，裸鼠肝癌移植瘤生长被抑制，肝内和肺转移能力降低，故认为LDHA是治疗原发性肝癌的潜在靶标。靶向肝癌细胞LDHA基因RNA干扰技术，对肝癌的侵袭和转移抑制作用研究尚未见其他文献报道。　　第三部分:LDHA参与肝癌生长和转移的分子机制研究　　为揭示针对上D尼4基因靶向治疗的抗肿瘤作用机制，我们首先应用nlumina基因芯片对分别转染LDHAshRNALenti.和ControlshRNALenti.的HCCLM3细胞进行全基因组扫描寻找差异表达基因，应用GO对基因进行功能聚类分析。根据差异基因芯片分析提供的线索，我们分别从葡萄糖代谢，凋亡和侵袭转移三个方面揭示LDHA参与肝癌生长和转移的分子机制。本研究中，我们共发现3268个差异表达基因，其中，上调差异表达基因1663个，下调差异表达基因1605个。通过GO数据库对基因功能注释并进行基因功能聚类分析发现，这些差异表达基因主要参与:能量代谢，黏附与受体相关生物学过程，信号转导，转录调节，炎症反应，酶相关生物学过程，金属离子结合，胶原与纤维蛋白相关生物学过程，细胞凋亡，血管发生，细胞增殖分化和发育，皮肤发育，免疫应答等生物学过程。　　根据差异基因芯片分析提供的线索，我们在体外细胞学水平，对LDHA影响糖酵解，凋亡和侵袭转移三个方面作了进一步实验验证。结果显示，转染LDHAshRNALenti.细胞葡萄糖消耗率下降，乳酸生成增加，氧消耗增加，ATP产生下降，提示下调LDHA可抑制肿瘤细胞的糖酵解水平，细胞增殖能力下降，肿瘤细胞可能转向耗氧更多的能量代谢途径，比如氧化磷酸化等，以满足自身生长代谢的需要;转染LDHAshRNALenti.细胞凋亡增加，其机制可能是氧化磷酸化水平增高，细胞内ROS产生增加，NAC可以清除因LDHA抑制引起的ROS产生增加，也可抑制ROS引起的凋亡增加。抑制LDHA表达致HCCLM3细胞的细胞线粒体膜电位下降，胞内Ca2+内流增加。Ca2+作为主要的细胞内信使，参与调控许多细胞和组织的生理活动，Ca2+释放，刺激PTP敏感性增加，促进PTP的开放，PTP的开放可增加线粒体外膜的通透性，促进细胞色素-c释放，活化Caspases-9，引发死亡蛋白酶Caspase级联反应，导致细胞凋亡;抑制LDHA基因表达可上调E-cadherin表达，下调FAK表达，二者呈现的最终的生物学作用均为抑制肿瘤细胞的转染和侵袭发能力。与ControlshRNALenti.组和PBS组相比，LDHAshRNALenti.组VEGF、MMP-2表达下降，抑制肿瘤细胞转移发生。综合以上结果，我们得出这样的推论:LDHA作为肝癌基因治疗新的靶点，其抗肿瘤的机制，除了能抑制肿瘤优势获能途径—糖酵解，减少能量供给外，还可促解氧化磷酸化过程，而氧化磷酸化增强引起了ROS产生等一系列氧化应激过程，最终导致肿瘤细胞凋亡发生。同时，LDHA具有癌基因的某些功能，调控着E-cadherin、FAK、VEGF和MMP-2等与侵袭转移相关的基因或蛋白质表达，下调肝癌细胞LDHA基因可以抑制肿瘤细胞侵袭转移能力。　　结论：　　1.LDHA在肝癌细胞系和肝癌组织中高表达，LDHA表达水平与肝癌细胞侵袭转移能力及肝内转移发生相关。　　2.RNA干扰下调LDHA表达后，肝癌细胞HCCLM3增殖侵袭能力下降，并引起裸鼠移植瘤肿瘤生长抑制，肝内和肺内转移率下降，生存期延长，故认为LDHA是潜在的治疗原发性肝癌侵袭、转移的靶标。　　3.LDHA基因与糖代谢过程、凋亡和侵袭转移等信号通路有关。抑制LDHA表达，可抑制糖酵解过程，减少ATP产生，细胞增殖能力下降;致肿瘤细胞ROS产生、Ca2+内流增加，影响线粒体膜电位，促进细胞色素-c释放，活化Caspases-9，引发死亡蛋白酶Caspase级联反应，导致细胞凋亡;抑制LDHA表达，可上调E-cadherin，下调FAK、VEGF和MMP-2表达，抑制肿瘤细胞的转染和侵袭能力。　　创新点：　　1.发现并证实LDHA参与肝癌侵袭转移过程，为预测和治疗原发性肝癌转移复发提供了新靶标。　　2.初步探索靶向LDHA的RNA干扰对肝癌细胞体外生长和侵袭的影响及抑制体内成瘤、转移的治疗效果。　　3.揭示了针对LDHA基因靶向治疗的抗肿瘤作用机制，证实LDHA基因与糖酵解过程、凋亡途径和侵袭转移等信号通路有关。抑制LDHA表达，可抑制肿瘤细胞能量供应，促进细胞凋亡，抑制或促进与侵袭转移相关的基因表达。　　潜在应用价值：　　1.LDHA是抑制肝癌复发转移的潜在治疗靶点。　　2.为针对LDHA基因靶向治疗的抗肿瘤药物设计提供线索。