小分子荧光探针应用于检测电泳后人血清蛋白质的方法研究

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本论文分为两个部分,第一部分为分子内电荷转移探针2,5-二羟基-4’-二甲氨基查尔酮(2,5-dihydroxy-4’-dimethylaminochalcone,DHDMAC)的设计、合成以及在电泳后人血清蛋白质荧光成像中的应用。我们将2,5-二羟基-4’-二甲氨基查尔酮及其系列衍生物(4-氨基-4’-二甲氨基查尔酮、2-羟基-4’-二甲氨基查尔酮以及4-甲氧基-4’-二甲氨基查尔酮)的蛋白质成像能力进行了对比,结果表明DHDMAC荧光成像法具有最佳的灵敏度和分辨率。此外,我们还对染色液的pH值、探针浓度以及缓冲溶液的浓度进行了优化,得到人血清蛋白质的最佳检测效果。为了评价DHDMAC作为蛋白质成像探针的性能,我们进行了灵敏度、双向电泳以及病人血清等一系列的实验,结果表明,该探针不仅具有简单的染色过程,而且还具有和银染法相当的灵敏度,它在凝胶中可以检测剑的转铁蛋白浓度为7.33ng/μL,而传统的CBB-R250染色法却只能检测到27.50ng/μL的转铁蛋白,DHDMAC荧光成像法的灵敏度比CBB-R250染色法提高了将近4倍。该方法还成功的检测到了一些传统染色方法检测不到的中低丰度疾病标志蛋白,如α1-抗胰凝乳蛋白酶、锌-α2-糖蛋白、肝组织α白蛋白、甲状腺素结合球蛋白以及血管紧张素原。此外,本文还将DHDMAC荧光成像法应用到了实际样品的分析中,成功的检测到了吸毒病人和正常人血清的不同之处。研究发现吸毒病人血清中的结合珠蛋白表达较低,而间α-胰蛋白酶抑制因子重链、抗凝血酶Ⅲ以及Anti-RhD单克隆T125kappa轻链的表达则比较高。因此,DHDMAC电泳荧光成像法是一种非常有潜力的蛋白质检测方法,为血清的临床分析开辟了一条新途径。  第二部分中,我们设计并合成具有聚集诱导荧光效应的小分子荧光探针—9,10-二[4-(3-磺酸丙氧基)-苯乙烯基]蒽磺酸钠盐(9,10-bis[4-(3-sulfonatopropoxyl)-styryl]-anthraxcenesodiumsalt,BSPSA)。首先,我们将BSPSA应用到了电泳后人血清蛋白质的检测中。BSPSA荧光成像法步骤简单,不需要繁杂的染色步骤且不需脱色,仅十分钟即可完成对人血清全蛋白的检测。BSPSA对蛋白质具有很高的灵敏度,它在溶液中可以检测到1nM的人血清白蛋白,在聚丙烯酰胺凝胶中可以检测到6.00ng的铁蛋白,其灵敏度可以和目前最灵敏的银染法相媲美。BSPSA荧光成像还可以检测出一些中低丰度的疾病标志蛋白,如锌-α2-糖蛋白、甲状腺互结合球蛋白和α2-HS-糖蛋白,这三种蛋白在临床检测上具有非常重要的意义。  另外,我们还将BSPSA应用到铝离子的荧光传感器研究中。实验结果表明,BSPSA的荧光会随着Al3+浓度的增大而逐渐增强,其对Al3+的线性浓度响应范围为1.19~16.66μM(32.13~449.82μg/L),检出限为0.38μM(10.26μg/L),具有较高的灵敏度。BSPSA对Al3+的选择性很好,常见的碱金属、碱土金属以及过渡金属对其检测基本没有干扰,溶液的pH值也不会影响BSPSA对Al3+的检测结果。因此BSPSA在对食品以及药物中Al3+的检测方面有着较广阔的应用前景。
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