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背景与目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,全球每年约有上百万人罹患乳腺癌。放射治疗作为乳腺癌局部和区域治疗的重要手段,涵盖着乳腺癌综合治疗的各个方面。但乳腺癌患者在接受放射治疗的过程中亦可能出现放疗后复发、放射抗拒、副作用大等一系列情况。因此目前放疗生物学研究主要集中在如何提高肿瘤放疗的治疗增益比(therapeutic gain factor,TGF),即增加放射对正常组织损伤和肿瘤杀伤之间的差别,提高射线对肿瘤杀灭的生物效应。增强肿瘤的放射敏感性,减轻放射的副作用是现在医学函待解决的问题。小檗碱又称黄连素,是从毛茛科植物黄连的干燥根茎提取的一种异喹啉类生物碱。小檗碱具有抗心律关常、心力衰竭以及降低血压、血脂和血糖和治疗消化性溃疡及免疫调节等多种作用。近年来多项研究表明小檗碱还对多种肿瘤细胞具有明显抑制效果。小檗碱主要通过抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移以及诱导细胞凋亡等机制实现抗肿瘤作用。它还能减轻放疗所致的肺损伤和肠粘膜损伤,通过诱导自噬对非小细胞肺癌起到放射增敏作用,通过下调RAD51提高食管癌的放疗敏感性。本课题主要研究小檗碱是否在乳腺癌放射治疗中具有增敏作用,并对其机制进行初步探讨。研究方法通过平板克隆实验检测小檗碱对人乳腺癌细胞(MCF-7和MDA-MB-468)是否具有放射增敏效果。DMSO或15μM小檗碱预处理细胞后予X线照射(0,1,2,3和4Gy)。铺入培养皿标准条件下培养2-3周,观察克隆形成情况。计算克隆形成率及细胞存活分数。用线性二次模型进行细胞存活曲线拟合。用线性回归分析对细胞存活曲线进行统计学分析。利用流式细胞仪检测细胞周期,比较小檗碱对乳腺癌细胞细胞周期变化的影响。将细胞分为放疗组和小檗碱联合放疗组,其中联合组加入15μM小檗碱预处理24h,两组细胞分别接受X线(6Gy)照射后0h、8h和12h时收集细胞。以标准程序用流式细胞仪检测,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。通过免疫荧光实验检测小檗碱处理对乳腺癌细胞接受X线(照射后γ-H2AX焦点的形成与持续情况的影响。将细胞接种于带有飞片的六孔板,15μM小檗碱预处24h后进行X线照射(1.0Gy),于0h、0.5h、4h和12h处理细胞,荧光显微镜下观察。通过western Blotting实验检测小檗碱对乳腺癌细胞接受X线照射前后细胞内RAD51、Ku70和Ku86折表达量有无影响。15μM小浆碱处理乳腺癌细胞24-48h后,检测RAD51、Ku70和Ku86(?)表达情况。15μM小檗碱处理乳腺癌细胞24h,予X线照射后0h,2h,6h和24h检测Ku70、Ku86和RAD51的表达,与单纯放疗组比较。结果本研究后通过平板克隆形成实验观察到小檗碱对乳腺癌MCf-7和MDA-MB-468细胞具I有明显的放射增敏作用。X线单独处理MGF-7细胞时,其SF2为31.2±0.8%,l而与小檗碱联合处理后其SF2降为20.5±3.9%,P=0.002。在MdA-MB-168细胞中可以看到类似的结果,单纯放疗组SF2为33.1±3.1%,小檗碱联合放疗组SF2为20.1±0.6%,P<0.0l。用线性二次模型进一步分析数据拟合细胞存活曲线,线性回归分析显示两条曲线间有明显的统计差异(P<0.001)。在另一种乳腺癌细胞系MDA-MB-468中可以看到类似的结果,小檗碱与放疗联合组SF2为20.1±0.6%,而单纯放疗组为33.1±3.1%,(P<0.01)。线性回归分析显示两条曲线间有明显的统计差异(P<0.001)。肿瘤细胞在经过离子辐射后细胞周期进程会延缓,出现G1/S期和(或)G2/M期的停滞,对损伤的DNA进行修复,避免出现致死性损伤,从而增强细胞的放射抵抗性。流式细胞仪检测结果显示,小檗碱可以诱导乳腺癌细胞(MCF7和MDA MB468)细胞周期改变,G0/G1期细胞增多(P<0.05),S期细胞明显减少(P<0.05),G2/M期变化不明显。小檗碱联合放疗组与单纯放疗组相比放疗诱导的G2/M期阻滞明显减少(P<0.05)。γ-H2AX是DNA损伤的敏感指标。通过免疫荧光法检测显示,单纯放疗组在0.5h时呈现大量的γ-H2AX焦点,在4h时焦点数明显=显减少,12h时焦点基本恢复到本底水平。而小檗碱与放疗联合组γ-H2AX焦点清除明显滞后,0.5h时呈现大量的γ-H2AX焦点,在4h时焦点数无明显减少,12h时焦点仍未恢复至本底水平。提示小檗碱与X线联合处理可以阻碍X线引起的乳腺癌MCF-7细胞的DNA DSBs修复。DNA双链断裂可以通过同源重组(homologous recombination, HR)(?)非同源重组(non-homologous end joining, NHEJ)两个基本过程被修复。参与HR修复的主要蛋白包括Rad51、BRCA1、BRCA2等,参与NHEJ修复的主要蛋白包括DNA-PKcs, Ku等。利用western Blotting方法检测发现,小檗碱可以使乳腺癌细胞RAD51表达下调,小檗碱联合放疗组中RAD51持续显著下调,Ku70、Ku86无明显变化,而对照组中Ku70、Ku86及RAD51均无明显变化。结论及意义小檗碱可以增加乳腺癌MCF-7和MDA-MB-468细胞的放射敏感性,其主要作用机制为通过抑制放疗诱导的G2/M期阻滞,下调DSB同源重组修复中重要分子RAD51的表达阻碍放疗导致的DNA损伤的修复。综上所述,小檗碱有可能成为一种新的有希望的放射增敏剂,本研究为小檗碱用于乳腺癌放疗增敏提供了理论依据。