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近年来由于荧光显微技术的发展,极大地推进了DNA单分子水平的研究。为了在单分子水平上探索DNA与蛋白质的相互作用,本课题主要通过分子梳技术对DNA分子及其DNA-蛋白质复合体进行拉伸,同时用荧光显微技术进行观察。
首先建立起了分子梳技术,实现了在不同的疏水薄膜上(PS、PMMA)用不同的方法(液滴蒸发法、旋涂法等)拉伸DNA分子,摸索出形成较好的DNA单分子梳的条件。
分子梳技术是一种强有力的、操作简便的在表面上拉伸DNA的方法。本文研究了Na+、Mg2+、溶液pH值对DNA分子拉伸的影响,首次观察到了DNA单分子由拉伸力导致的熔化现象。
不仅对DNA单分子进行了拉伸,本文在疏水薄膜上对DNA-组蛋白复合体进行了拉伸,也形成了好的单分子梳,研究了DNA与组蛋白间的相互作用。组蛋白使DNA发生明显的凝聚现象,DNA-组蛋白复合体的拉伸长度与组蛋白的浓度、碱基对和荧光染料的比例有着显著的关系。
应用分子梳技术研究了DNA与RecQ解旋酶间的相互作用,得到了DNA-RecQ复合体的单分子梳分布,以及解旋后复合体分子梳分布;荧光显微观察表明DNA与RecQ较易结合,RecQ使λ-DNA发生明显的解旋。原子力显微观察表明RecQ在溶液中单独存在时,以单体形式存在;能以单体形式与DNA结合,RecQ使λ-DNA发生解旋。
用分子梳技术研究了一价(Na+、K+)金属离子,二价金属离子(Mg2+、Ca2+、Mn2+)对DNA与组蛋白结合的影响;同时还进行了反应液荧光强度、荧光偏振度的检测。结果表明:一价离子、二价离子与DNA结合方式可能不同。二价离子与DNA结合过程中,使DNA的构型发生了一些变化。二价离子与组蛋白共同存在时,它们与DNA的结合起着相互促进的作用。