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研究背景类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)在中医理论中属于“痹症”范畴,临床中寒证和热证是两种最为常见的证型。乌头汤是治疗RA寒证的经典方剂,具有疗效好、可持久服用以及毒性低的优势。然而,现阶段乌头汤发挥缓解RA寒证的药效物质基础和作用机理尚不明确,严重阻碍了乌头汤在临床中的广泛应用。因此,亟需应用现代药理研究方法,鉴定乌头汤缓解RA寒证的药效物质基础,进而揭示其作用机制。研究目的本项研究通过全基因组表达谱和网络药理学分析,将药物靶标预测、网络分析、分子对接、表面等离子体共振(Surface plasma resonance,SPR)和药代动力学等方法和体内外实验验证相结合,筛选乌头汤缓解RA寒证的关键药效物质基础,并探究其潜在作用机制。研究方法1.基于佐剂诱导型关节炎(Adjuvant-induced arthritis,AIA)病证结合大鼠模型和全基因组表达谱分析,考察乌头汤缓解AIA寒证与热证的药效差异和网络调控机制1.1 AIA模型的建立1.1.1单纯AIA模型的建立:选用健康6-8周龄雄性Lewis大鼠,每只大鼠单次尾根皮内注射0.1mL完全弗式佐剂(10 mg/mL)热灭活的结核分枝杆菌酪酸的液体石蜡混悬液,Difco),诱导AIA模型;1.1.2 AIA寒/热性关节炎模型的建立:在复制AIA模型的同时,模拟类RA致病原因,分别施加外界风寒湿(风速6 m/s,相对湿度均为60%,温度为6℃,连续15天)、风湿热(风速6 m/s,相对湿度均为90%,温度为37℃,连续15天)条件刺激,造成AIA寒性和AIA热性模型;1.2动物分组与给药雄性Lewis大鼠36只,每组6只。组别如下:空白组、AIA模型组、AIA-寒证模型组、AIA-热证模型组、AIA-寒证+乌头汤组(7.5 g/kg,2倍临床剂量)和AIA-热证+乌头汤组(7.5 g/kg,2倍临床剂量)。大鼠给药按照1mL/100g体重灌胃,从免疫当天开始给药,同时,正常对照组和模型组灌服等容积蒸馏水。给药至免疫第27天进行动物取材。1.3关节炎评价1.3.1疾病严重度指标评价:观察并记录各组大鼠的疾病严重情况(疾病发生率、关节炎临床评分、右后肢肿胀度、体重、炎性因子水平、胸腺指数、脾脏指数和痛阈)。疾病发生率:给药结束后,记录每组中发病大鼠的只数/大鼠总只数的比例;右后肢肿胀度:自免疫8天开始,每2日用游标卡尺测量大鼠的右后肢直径,截止至取材前一天;体重:自免疫第一天开始,每周测量大鼠体重两次,截止至取材前一天;炎性因子水平:以酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定正常组、AIA模型组和给药组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1 β、IL-17、IFN-γ含量;胸腺指数:于取材当天收集并称量大鼠胸腺,除以相应的大鼠体重,计算胸腺指数(mg/g);脾脏指数:于取材当天收集并称量大鼠脾脏,除以相应的大鼠体重,计算脾脏指数(mg/g);痛阈:以Von frey hair机械疼痛测试仪、热辐射疼痛测试仪和丙酮测量各组大鼠痛阈,分别在造模前、造模后测量(每隔2天测量一次),每次测量维持3个周期,中间间隔5min;1.3.2病证结合指标评价:观察并记录各组大鼠的病证结合指标情况(关节表面温度、肝脏Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、大鼠血浆T3、T4、促甲状腺激素、促甲状腺释放激素的含量和每日饮水量)。关节表面温度:从发病第一天开始,每日通过红外热像仪测量雄性Lewis大鼠左足的关节表面温度;肝脏Na+-K+-ATP酶/Ca2+-Mg2+-ATP酶/琥珀酸脱氢酶/乳酸脱氢酶/大鼠血浆T3/T4/促甲状腺激素/促甲状腺释放激素含量:大鼠取材后,收集血清,运用Elisa或生化法测量上述指标含量;每日饮水量:运用量筒测量每组大鼠每日饮水量;1.4全基因组表达谱分析1.4.1滑膜样本收集与芯片处理:收集于给药第27日取材的发现集大鼠滑膜组织,浸入Trizol(Invitrogen,CA,USA)试剂后,立即转移至液氮中待测。对大鼠滑膜所含总RNA进行抽提和纯化后,运用Agilent大鼠全基因组表达谱芯片4×44K(CatNo.:014879,Santa Clara,California,USA.)进行 RNA 的放大、标记和杂交;1.4.2数据收集:完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner(Cat.#G2565CA,Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)进行扫描,并运用Affymetrix GeneChip Operating · Software(GCOS;version 1.4)筛选 log2 ratio ≥ 1 或 log2 ratio ≤-1 和 P-value<0.05 的基因;1.4.3数据分析:运用Agilent GeneSpring GX software进行差异基因层级聚类以识别差异表达基因,并基于欧氏距离进行聚类分析。接着,将相关基因上传至 Gene Ontology(G0,http://www.geneontology.org/)数据库进行 G0 生物学过程富集分析,研究其靶点生物过程,并进行KEGG信号通路富集分析;1.5网络构建与分析1.5.1乌头汤效应基因-RA寒热候选靶标基因相互作用网络的建立:基于String数据库(http://string-db.org/,version 10.5),提取乌头汤候选靶标分子与RA寒热候选靶标基因的相互作用信息,并构建药物靶标分子网络。采用Navigator software(Version 2.2.1)进行网络可视化。1.5.2网络拓扑特征值计算:计算上述“药物靶标-疾病基因”互作网络中网络节点的拓扑特征值(连接度、介度、紧密度),筛选三者均大于相应中位数的节点为乌头汤干预RA寒证与热证相关失衡网络的关键候选靶点,进行通路富集分析。2.乌头汤缓解AIA寒证的关键药效物质基础发现和相关作用机制研究2.1分子对接2.1.1乌头汤关键候选靶点与活性成分结构收集乌头汤干预RA寒证相关失衡网络的关键候选靶点结构收集:从蛋白银行库(PDB,https://www.rcsb.org/)中获取相关靶标的三维结构及活性口袋信息。如果存在靶标与小分子的复合物晶体结构,则直接根据复合物晶体结构中的小分子所在位置定义为活性口袋,否则对靶标进行表面口袋分析,挑选最大的口袋进行对接分析;乌头汤缓解RA寒证的活性成分结构收集:基于本课题组前期对乌头汤所含化学成分的鉴定,以及药物吸收-分布-代谢-排泄(Absorption-distribution-metabolism-excretion,ADME)评估,筛选出具有生物活性的化学成分,使用Open Babel将相关活性成分的二维结构转换为三维结构;2.1.2分子对接分析运用 SimBioSys 公司的分子对接软件 eHiTS(eHiTS 6.0,SimBioSysInc.eHiTS,Canada)进行分子对接分析,对接分数大于4.0表示对接化合物与靶标之间有较强的亲和力,筛选出乌头汤缓解RA寒证疾病严重度的关键候选药效物质。2.2 SPR2.2.1乌头汤关键候选药效物质和候选靶标准备:购买或合成分子对接筛选得出的与乌头汤关键候选靶点有较强亲和力的候选药效物质,以及具有蛋白活性的候选靶标蛋白;2.2.2 SPR分析:将待检测蛋白以氨基耦合的形式固定于CM5传感芯片上,运用Biacore T200 instrument(BIACORE T200,GE,USA),验证分子对接结果,计算解离常数KL;2.3药代动力学检测2.3.1样本收集:饲养雄性Lewis大鼠18只,分为3组,每组6只。组别如下:空白组、空白组+BAC(bioactive compounds,BAC)(乌头汤缓解RA寒证关键药效物质基础组合)、空白组+乌头汤组(7.5 g/kg,2倍临床剂量)。灌胃给与乌头汤和 BAC 后,在不同时间点(0,0.083,0.25,0.5,1,2,4,8,12 和 24h)通过眼内眦取血(1mL/次),放入肝素钠抗凝管内12000rpm离心15分钟,取上清分装至EP管内待测;2.3.2药代动力学分析:运用液相-质谱联用分析系统(UPLC-MS/MS,AcQuityTM UPLC/API 5500 Qtrap)检测给药后不同时间点大鼠血清中乌头汤候选药效物质的含量,计算药物半衰期等药代动力学指标。3.乌头汤关键药效物质PAE和TLT组成的BAC缓解RA寒证与热证的药效学差异及其作用机制验证3.1 AIA模型的建立(同1.1)3.2动物分组与给药雄性Lewis大鼠101只。组别如下:空白组(n=9)、AIA-寒证模型组(n=9)、AIA-热证模型组(n=9)、AIA-寒证+乌头汤给药组(n=9,7.5g/kg,2倍临床剂量)、AIA-寒证+BAC给药组(n=9,同等剂量乌头汤等量换算)、AIA-寒证+塔拉定(Talatizidine,TLT)给药组(n=5,同上)、AIA-寒证+芍药苷(Paeoniflorin,PAE)给药组(n=5,同上)、AIA-寒证+甲氨喋呤(Methotrexate,MTX)给药组(n=9)、AIA-热证+乌头汤给药组(n=9,7.5g/kg,2倍临床剂量)、AIA-热证+BAC(n=9,同上)、AIA-热证+TLT给药组(n=5,同上)、AIA-热证+PAE给药组(n=5,同上)、AIA-热证+MTX给药组(n=9)。大鼠给药按照1 mL/100g体重灌胃,从免疫当天开始给药,同时,正常对照组和模型组灌服等容积蒸馏水。给药至免疫第27天进行动物取材。3.3关节炎评价3.3.1疾病严重度指标评价:观察并记录各组大鼠的疾病严重情况(疾病发生率、关节炎临床评分、右后肢肿胀度、体重、炎性因子水平、胸腺指数、脾脏指数和痛阈),并运用苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)和甲苯胺蓝染色观察正常对照组、模型组以及各给药组大鼠右后肢的病理变化;3.3.2病证结合指标评价(同1.3.2);3.3.3肝肾毒性评价肝肾指数:于取材当天收集并称量大鼠肝脏和肾脏,除以相应的大鼠体重,计算肝脏指数和肾脏指数(mg/g);肝肾生化指标:大鼠取材后,收集血清,运用Elisa法测量反应肝脏毒性的指标丙氨酸转氨酶和谷草转氨酶,以及反应肾脏毒性的指标尿素和肌酐水平;肝肾病理变化:运用HE染色观察正常对照组、模型组以及各给药组大鼠肝脏和肾脏的病理变化;3.4细胞培养人成纤维滑膜细胞(Human Fibroblast like Synoviocytes,HFLS-RA)和3T3-L1前脂肪细胞按常规培养于含90%基础细胞培养基、10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)及 1%双抗(Penicillin-Streptomycin,PS)的完全培养基中,置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内孵育;3.5细胞诱导及药物干预3.5.1 HFLS-RA:HFLS-RA的代数均4代到8代,通过10 ng/mL的白介素-1 β(Interleukin-1 β,IL-1 β)诱导后,分别由0.4 μ g/m乌头汤、BAC(同等剂量乌头汤换算)和0.2 μ g/mL MTX作用24h,再进行体外验证;3.5.2 3T3-L1前脂肪细胞细胞活性检测:将乌头汤和BAC分别设置八个浓度,即0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8和25.6 μ g/mL,计算IC50值,确定给药浓度;3T3-L1前脂肪细胞诱导及染色:运用经典三联法(成脂激素3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素)诱导3T3-L1前脂肪细胞成脂。待细胞成脂后,运用油红氧染色观察;药物对成脂影响的药效学评价:实验分为四组,分别为空白对照组、经典三联法诱导模型组、经典三联法+乌头汤给药组和经典三联法+BAC给药组,在诱导第三天提取蛋白做Western blot,验证两药对PPAR-γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma)、PGC 1 α(PPAR-γ coactivator 1alpha)、UCP1(uncoupling protein 1)和 PRDM16(PR domain containing 16)产热相关蛋白表达的影响,并待实验第七天左右脂肪细胞形成时,运用油红氧染色观察不同组别细胞成脂;BAC对3T3-L1脂肪细胞作用的机制验证:待3T3-L1前脂肪细胞产生接触抑制2天后,siRNA-PPARG/siRNA-control转染6小时,换正常培养基培养作用24小时,换诱导液(含有相应浓度的乌头汤或BAC)诱导成脂。实验分为八个组,分别为空白组、经典三联法诱导模型组、经典三联法诱导模型+siRNA-PPARG组/siRNA-PPARG+乌头汤组/siRNA-PPARG+BAC 组/siRNA-Control 组/siRNA-Control组+乌头汤/siRNA-Control组+BAC组。待诱导第三天,提取蛋白,检测不同组别中PPAR-γ、PGC-1 α、UCP1和PRDM16蛋白表达水平。3.6相关蛋白表达水平检测运用Western blot检测各组动物关节软骨中和体外培养HFLS-RA中的ALOX15B(arachidonate 15-lipoxygenase,type B)、c-JUN、PPAR-γ、FGF2(fibroblast growth factor 2)、PTGS2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2)、MMP13(matrix metalloproteinase 13)、IL-1 β 和 TGF-β 1(transforming growth factor beta 1)候选靶标的表达水平。并运用免疫组化染色检测各组动物关节软骨中核受体蛋白PPAR-γ和c-JUN的表达。研究结果1.乌头汤在缓解AIA寒证和热证大鼠的疾病严重度方面存在药效差异,其作用机理也不同1.1乌头汤可有效缓解AIA寒证大鼠的疾病严重度,而对AIA热证大鼠的疾病改善作用不显著1.1.1乌头汤能缓解AIA寒证大鼠的关节炎严重程度:从表征上看,AIA、AIA寒证和AIA热证模型大鼠关节红肿、畸形症状表现明显,乌头汤作用后可显著改善AIA寒证模型组大鼠的疾病严重度,具体表现为降低AIA寒证模型组大鼠的疾病发生率、关节炎临床评分、右后肢肿胀度、各炎性因子水平,以及胸腺指数和脾脏指数,缓解各模型组大鼠下降的体重和痛阈,而对AIA热证模型组大鼠的疾病严重改善情况不明显;1.1.2乌头汤能改善AIA寒证大鼠的病证结合指标:与空白对照组与AIA模型组相比,AIA寒证模型组大鼠的关节表面温度、肝脏Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、大鼠血浆T3、T4、促甲状腺激素、促甲状腺释放激素的含量和每日饮水量均显著下调,乌头汤可有效提高AIA寒证模型组大鼠各病证结合指标,而对AIA热证模型组大鼠的各病证结合指标改善情况不显著;1.2乌头汤缓解RA寒证的作用机制与其对产热和能量代谢,以及机体炎症-免疫系统相关通路的调节有关基于全基因组表达谱差异基因分析所得AIA寒证相关基因、AIA发病相关基因和已知RA相关基因之间的相互作用关系,建立AIA寒证相关分子网络,该网络包含422个节点(其中,225个AIA寒证相关基因,33个AIA发病相关基因,170个已知RA相关基因)和1939对相互作用。计算并衡量上述网络中422个节点的拓扑中心性,筛选得到141个AIA寒证相关分子网络中的关键节点。通过功能挖掘,发现上述141个AIA寒证关键网络节点主要参与炎症-免疫调节相关生物学反应,以及热量产生调节相关生物学反应;利用乌头汤处理AIA寒证大鼠前后的差异基因,及上述141个AIA寒证关键网络节点之间的相互作用,建立乌头汤干预寒证相关分子网络,包含179个节点(其中,57个寒证关键网络节点,40个乌头汤缓解寒证相关基因,82个已知RA相关基因)和1095对相互作用。根据上述网络节点的拓扑中心性,筛选到63个乌头汤干预寒证分子网络的关键节点。功能挖掘表明此63个乌头汤干预寒证分子网络的关键节点富集显著性最高的生物学反应均与产热调节相关,其次是与炎症-免疫调节相关的生物学反应。接着,在所得的乌头汤缓解寒证相关基因和寒证关键网络节点中,挖掘得出ALOX15B和FGF2两个冗余基因,提取ALOX15B和FGF2的直接相互作用对象,建立其相互作用子网,并对子网节点的功能进行挖掘,结果发现这些节点分子最显著富集于与产热相关的生物学反应,其次,是与能量生成相关的生物学反应,再次,是与激素应答相关生物学反应。因此,推测与产热和能量代谢,以及维持机体炎症-免疫系统平衡相关的ALOX15B-PPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1 β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1信号通路是乌头汤缓解RA寒证的关键靶标;1.3乌头汤缓解RA热证的作用机制与其对机体抗炎-免疫系统相关通路的调节有关基于全基因组表达谱差异基因分析所得AIA热证相关基因、AIA发病相关基因和已知RA相关基因之间的相互作用关系,建立AIA热证相关分子网络,该网络包含236个节点(其中,48个热证相关基因,21个AIA发病相关基因,165个已知RA相关基因)和1203对相互作用。计算并衡量上述网络中236个节点的拓扑中心性,筛选得到82个AIA热证相关分子网络中的关键节点。通过功能挖掘,发现上述82个AIA热证关键网络节点绝大多数都参与炎症-免疫调节相关的生物学反应;利用乌头汤处理AIA热证大鼠前后的差异基因,及上述82个AIA热证关键网络节点之间的相互作用,建立乌头汤干预热证相关分子网络,包含88个节点(其中,15个热证相关基因,8个乌头汤缓解热证相关基因,65个已知RA相关基因)和566对相互作用。根据上述网络节点的拓扑中心性,筛选到32个乌头汤干预热证分子网络的关键节点。功能挖掘表明此32个乌头汤干预热证分子网络的关键节点富集显著性最高的生物学反应均与炎症-免疫调节相关。接着,在所得的乌头汤缓解热证相关基因和热证相关基因中,挖掘得出CD3G和THBS1两个冗余基因,提取CD3G和THBS1的直接相互作用对象,建立其相互作用子网,并对子网节点的功能进行挖掘,结果发现这些节点分子绝大多数均富集于与炎症-免疫调节相关的生物学反应;2.PAE和TLT是乌头汤发挥缓解AIA寒证的候选关键药效物质2.1 PAE 和 TLT 与 ALOX15B-PPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1 β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1信号通路中关键靶标有较强的亲和力基于本课题组前期对乌头汤所含化学成分的鉴定,以及药物ADME评估,筛选出了具有生物活性的化学成分。接着,将这些具有生物活性的化学成分与靶标蛋白进行分子对接检测,发现乌头汤所含PAE(2201.32 μ g/mL,等量换算0.75g/mL乌头汤)与TLT(0.72 μ g/mL,等量换算0.75g/mL乌头汤)和PPAR-γ、c-JUN、MMP13以及TGF-β 1有较强的亲和力(对接分数>4.0)。SPR检测表明 PAE 与 c-JUN(KD=30.3 μ M)和 MMP1(KD=6.57 μM),以及 TLT 定与 TGF-β 1(KD=89.1 μ M)和MMP13(KD=2.63 μ M)有较强的亲和力;2.2累积给药后,乌头汤和BAC中所含的PAE和TLT在大鼠体内有较高的累积浓度雄性Lewis大鼠连续给药12天后,BAC中PAE与TLT的峰时间分别为0.63h和0.80h,比乌头汤给药后的发达峰时间(PAE、TLT的达峰时间分别为1h和1.6h)短。峰浓度(Cmax)为775、34.0 ng/ml,分别是乌头汤给药的3.51和14.0倍,AUCINF_obS为2313和112 ng·h/mL,分别是乌头汤给药的1.29和5.62倍,即BAC给药后PAE、TLT的体内暴露均高于乌头汤给药的体内暴露。综上,推测PAE和TLT为其发挥缓解RA寒证的关键药效物质;3.PAE和TLT组成的BAC可有效缓解AIA寒证大鼠的疾病严重度,其作用机理与对 ALOX15B-PPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1 β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1 信号通路的调节有关3.1 BAC可有效缓解AIA寒证大鼠的疾病严重度,而对AIA热证大鼠的疾病改善作用不显著3.1.1 BAC能缓解AIA寒证大鼠的关节炎严重程度:从表征上看,AIA、AIA寒证和AIA热证模型大鼠关节红肿、畸形症状表现明显,BAC作用后可显著改善AIA寒证模型组大鼠的疾病严重度,具体表现为降低AIA寒证模型组大鼠的疾病发生率、关节炎临床评分、右后肢肿胀度、各炎性因子水平,以及胸腺指数和脾脏指数,缓解各模型组大鼠下降的体重和痛阈,以及受累关节病理变化,与乌头汤和阳性药MTX相比无显著性差异,而对AIA热证模型组大鼠的疾病严重改善情况不明显;3.1.2 BAC能改善AIA寒证大鼠的病证结合指标:与空白对照组与AIA模型组相比,AIA寒证模型组大鼠的关节表面温度、肝脏Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、大鼠血浆T3、T4、促甲状腺激素、促甲状腺释放激素的含量和每日饮水量均显著下调,BAC可有效提高AIA寒证模型组大鼠各病证结合指标,与乌头汤和阳性药MTX相比无显著性差异,而对AIA热证模型组大鼠的各病证结合指标改善情况不显著;3.1.3 BAC对各组大鼠的肝肾毒性:与空白对照组相比,AIA各模型组和给药组大鼠的肝肾指数、生化指标以及病理均无明显变化;3.2 BAC可显著调节 AIA寒证大鼠模型中 ALOX15B-PPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1信号通路中相关分子的异常表达,而对AIA热证大鼠中相关分子表达的调节不显著Western blot检测表明,与空白组相比,AIA组、AIA寒证模型组和AIA热证模型组大鼠炎症关节中 ALOX15B-PPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1 β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1信号通路中各蛋白均异常表达,BAC可显著调节AIA寒证模型组大鼠关节中相关蛋白的异常表达,而对AIA热证模型组大鼠的调节作用并不显著。免疫组化结果表明,AIA寒证模型组大鼠软骨中核受体蛋白PPAR-γ表达下调,c-JUN表达上调,BAC可有效扭转这一趋势,而对AIA模型组和AIA热证模型组大鼠中的核受体蛋白PPAR-γ和c-JUN的调节作用不显著,其调节作用与乌头汤和MTX相当;3.3 BAC 可显著调节 IL-1 β 诱导的 HFLS-RA 细胞中 ALOX15B-PPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1 β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1信号通路相关分子的异常表达BAC 可有效调节 IL-1 β 诱导后 HFLS-RA 细胞中ALOX15β-PPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1 β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1信号通路相关分子的异常表达,与乌头汤和阳性药MTX相比无显著差异,与体内整体实验相一致;3.4 BAC对3T3-L1前脂肪细胞未见明显细胞毒性计算所得BAC和乌头汤作用于3T3-L1的IC50值分别为5.9μg/mL和5.626 μ g/mL,大于针对HFLS-RA细胞的给药量0.4 μ g/mL,因此,在此剂量下对3T3-L1前脂肪细胞不产生毒性作用3.5 BAC可促进3T3-L1前脂肪细胞成脂油红0染色表明0.4 μ g/mL的乌头汤和同等剂量下的BAC可促进经典三联法诱导后3T3-L1前脂肪细胞成脂,同时,提高模型组中PPAR γ、PGC-1 α、PRDM16和UCP1蛋白表达水平,其作用与乌头汤相当;3.6 BAC可激活3T3-L1脂肪细胞中PPAR-γ产热相关信号通路与模型组相比,转染siRNA-PPARG(100nM)后的3T3-L1细胞中PPAR γ、PGC-1 α、PRDM16和UCP1蛋白表达水平较低,BAC对此四种蛋白调节作用不显著。而转染 siRNA-Control(100nM)后的 3T3-L1 细胞中 PPAR γ、PGC-1 α、PRDM16和UCP1蛋白表达水平无显著性差异,BAC可显著上调此四种蛋白表达,其作用与乌头汤相当。研究结论本研究采用药物靶标预测、网络分析、分子对接、SPR、药代动力学检测等方法和体内外实验验证相结合的方法,筛选乌头汤缓解RA寒证的关键药效物质,并探究其潜在作用机制。相关研究结论如下:(1)基于具有RA寒证、RA热证表型的AIA大鼠滑膜组织的芯片检测数据,本研究分别建立AIA寒证、AIA热证相关分子网络,并通过网络节点拓扑特征计算和功能挖掘,揭示AIA寒证相关分子特异地与能量代谢、激素调节和血液动力学相关生物学反应或信号通路相关,AIA热证相关分子则特异地与炎症-免疫系统调节相关生物学反应或信号通路相关,而AIA寒证和AIA热证相关分子共同参与细胞外基质调节、细胞黏附和神经系统调节相关的生物学反应或信号通路;(2)经“病证标志-药物靶标”网络构建和分析,发现乌头汤对于AIA寒证和AIA热证分子网络干预机制明显不同。乌头汤干预AIA寒证分子网络的作用靶点最显著的功能是参与机体的产热和产能,其次,是与抗炎-免疫相关。进一步分析挖掘发现,ALOX15B-PPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1 β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1信号通路(与产热和能量代谢,以及维持机体炎症-免疫系统平衡相关)可能是乌头汤缓解RA寒证的关键靶标。而乌头汤对AIA热证分子网络的作用靶点较为集中的功能是参与抗炎-免疫调节;(3)结合乌头汤所含化学成分的鉴定、药物ADME评估、分子对接、SPR以及药代动力学检测,发现 PAE 和 TLT 与 ALOX15B-PPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1 β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1信号通路中相关蛋白有较强的亲和力,且在大鼠体内有较高的生物体内积聚,因此,推测PAE和TLT为乌头汤缓解RA寒证的关键药效物质;(4)基于AIA寒证和AIA热证病证结合动物实验验证表明,PAE和TLT组成的BAC可显著缓解AIA寒证模型组大鼠的疾病严重度,包括改善疾病严重度指标和病证结合指标,并扭转 ALOX15B-PPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1 β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1信号通路的异常变化,其药效与作用机理与乌头汤相当;(5)基于HFLS-RA细胞和3T3-L1前脂肪细胞的体外研究表明,BAC一方面通过调节炎症-免疫相关通路缓解疾病严重度,另一方面通过上调PPAR-γ共激活因子诱导的脂肪生成相关蛋白(UCP1,PGC-1 α,PRDM16),促进脂肪生成,从而发挥产热作用,其作用与乌头汤相当。综上所述,本研究基于全基因组表达谱和网络药理学分析,将药物靶标预测、网络分析、分子对接、SPR和药代动力学等方法和体内外实验验证相结合,发现乌头汤是通过调节机体产热/能量代谢和炎症/免疫平衡相关信号轴--ALOX15BPPAR-γ-PTGS2-FGF2-IL-1 β-c-JUN-MMP13-TGF-β 1,发挥其缓解类风湿关节炎寒证的药效,而来自君药乌头的塔拉定和来自使药白芍的芍药苷是乌头汤发挥该药效的关键药效物质。初步揭示了其“疗寒以热药”的调节机理及其与功效的相关性,为后续开展RA个体化治疗研究提供方法学的探索和实验依据。