当前,海洋的污染正在日趋加剧,其中海洋的石油污染尤为严重。世界日原油产量大约108barrels,其中50%经由海洋运输。即使是偶尔发生的溢油事件,也会对海洋环境和海岸生态系统造成了恶劣和长期的影响。目前普遍认为生物修复是清除海洋石油污染的有效手段。从海洋石油污染较严重的环境中进行石油烃降解微生物的分离、培养,以及对这些重要降解菌的鉴定是当前海洋环境微生物学研究的重点和热点。烷烃羟化酶是微生物降解烷烃过程中的第一步酶,也是整个降解途径中的关键酶。它们能够使极性、难溶的烷烃转变为溶解性高的醇类物质,这不仅有利于微生物本身对烷烃的降解,也有利于参与降解的其它微生物的利用。此外,烷烃羟化酶可以用作生物催化机来生产一些精细化工产品,。因此,对烷烃降解菌和烷烃羟化酶的研究具有较高的理论和应用价值。本文以柴油为唯一碳源,从马六岬海峡10个不同站点的表层海水样品中富集到了十个柴油降解菌群,并对各菌群的结构进行了分析。从10个菌群中共分离到48株细菌,分属于17个不同的属。其中许多菌株都有较强的柴油降解能力。降解菌群中可培养菌的系统发育分析表明,它们分别属于变形菌类群、放线菌类群、黄杆菌类群,多样性丰富。其中变形纲类群γ亚群(59%)、α亚群(33%)较为丰富。PCR-DGGE分析表明,食烷菌、假单胞菌、海旋菌、海杆菌、新鞘氨醇单胞菌、不动杆菌、红球菌、Parvibaculum、苍白杆菌属的细菌是优势菌。其中大多数菌已报道可以降解原油或柴油。从马六岬海峡红灯码头站点分离到的A-11-3对柴油具有很强的降解能力及很广的烷烃降解范围(C8～C36)。其16S rRNA与已报道的博克岛食烷菌SK2(Alcanivorax. borkumensis SK2T)有最高同源性为96.5%。通过生理生化特性分析、脂肪酸组成分析、G+Cmol%含量分析、ITS序列以及促旋酶gyrB序列等分析,表明菌株A-11-3是属于食烷菌属的一个新种,命名为马六岬食烷菌(Alcanivorax Malaccasis)。从该菌株中获得了一个新的烷烃羟化酶AlkB(Burkholderia xenovorans LB400,69%)和一个属于细胞色素CYP153家族的P450烷烃羟化酶的部分序列。从本实验室分离并鉴定的柴油食烷菌模式种B-5(A.dieselolei)获得了一个新的烷烃羟化酶AlkB,以前的实验证明,该基因编码一个有功能的烷烃羟化酶。本实验在B-5中对alkB基因进行了敲除,发现基因敲除后的突变株对烷烃的降解范围和降解能力与原始菌株相比,几乎没有差别,这说明了在B-5中还存在其它的烷烃羟化酶系统。用兼并引物和Tail-PCR扩增的方法获得了367个氨基酸的细胞色素P450酶,其与博克岛食烷菌SK2中CYP153 P450烷烃羟化酶有最高相似性,为84.9%。系统发育分析表明,B-5中得到的P450酶属于细胞色素CYP153家族。还获得了位于其下游且紧邻P450烷烃羟化酶的541aa的醇脱氢酶全长。在B-5及在突变株B-5△alkB中分别进行CYP 153 P450基因敲除的单双突变株已经构建好,突变株的烷烃降解能力实验正在进行中。此外B-5中已获得的两个烷烃羟化酶AlkB及P450在不同烷烃的诱导下的表达情况的研究正在进行之中。