目的:肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)几乎是所有慢性肾脏疾病进行性发展的共同通路,是导致终末期肾病的主要病理基础。大量的研究表明,在各种原因引起的慢性肾脏疾病中,肾间质纤维化都可作为肾功能恶化的一个十分准确的预测指标。肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性比肾小球硬化与肾功能的相关性更为密切。肾间质纤维化的一个重要机制就是肌成纤维细胞(myofiberoblast,Myof)增多及活化。目前Myof的来源还不完全清楚,但越来越多的研究证实肾小管上皮细胞的表型转化,或者称为肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转变(epithelial- myofiberoblast transition, EMT)是其主要来源之一,但其信号传导机制至今尚未阐明。Janus kinase/ signal transducer and activators of transcription(JAK/ STAT)信号途径能介导多种细胞因子和生长因子的细胞内信号转导过程,与细胞的增殖、分化、凋亡等多种行为密切相关。研究表明,高糖和血管紧张素II等均可激活体外培养的肾小球系膜细胞JAK/STAT途径。但此信号途径在肾小管上皮细胞转分化中的作用鲜见研究报道。血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor,ACEI)和血管紧张素II受体阻断剂(angiotensin recepter blockade, ARB)具有肾脏保护作用,已成为治疗慢性肾衰的常用药物,但其对EMT的影响目前研究较少。本研究应用高糖培养人肾小管上皮细胞株(HKC)和大鼠5/6肾切除(5/6 subtotal nephrectomy STNX )模型,从整体、细胞和分子等不同水平,系统观察了EMT及其过程中JAK/STAT信号途径的变化,以及血管紧张素II受体阻断剂和补肾活血方剂的影响,以进一步探讨EMT在慢性肾纤维化中的作用及其发病机制和防治措施。方法1.体外培养HKC细胞EMT及JAK/STAT信号途径的检测HKC分成4组:LG组(5.5mmol/L葡萄糖);LG+M组(5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇);HG组(30mmol/L葡萄糖);HG+AG490组(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L AG490)。分别在24孔板和25 cm2塑料培养瓶内培养。培养6、12、24、48、72h后收集细胞,提取细胞总蛋白、RNA及采集细胞上清液。采用免疫沉淀和Western印迹检测JAK2磷酸化表达;免疫荧光细胞化学和Western blot检测STAT1、STAT3、p-STAT1、p-STAT3、α-SMA和E-Cadherin等的表达;半定量RT-PCR检测细胞TGF-β1mRNA的表达;酶联免疫法检测细胞上清液中I型胶原和TGF-β1的分泌。2.缬沙坦治疗后HKC细胞EMT及JAK/STAT信号途径变化的检测HKC分成3组:LG组(5.5mmol/L葡萄糖); HG组(30mmol/L葡萄糖);HG+Val组(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L缬沙坦)。分别于刺激的6、12、24、48、72h后收集细胞,提取细胞总蛋白、RNA及收集细胞上清液。采用免疫荧光细胞化学和Western blot检测STAT1、STAT3、p-STAT1、p-STAT3、α-SMA和E-Cadherin等的表达;免疫沉淀和Western印迹检测JAK2磷酸化表达;半定量RT-PCR检测细胞TGF-β1mRNA的表达;酶联免疫法检测细胞上清液中I型胶原和TGF-β1的分泌。3.氯沙坦治疗后对STNX大鼠的EMT及JAK/STAT信号途径的检测54只SD雄性大鼠随机分为假手术组、STNX组和STNX+氯沙坦组,治疗组每日给予氯沙坦20mg·Kg·d-1灌胃,各组分别于2次手术后第4、8、12周各取6只大鼠,称重后收集24h尿,测定尿蛋白(Upro);取血测定尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr);取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定用于光镜观察及免疫组化检测,部分肾皮质组织用于分离肾小管细胞,提取细胞总RNA和总蛋白。免疫组织化学染色法和Western blot检测肾小球α-SMA、JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3和p-STAT3蛋白表达;免疫沉淀和Western blot检测JAK2酪氨酸磷酸化;半定量RT-PCR检测肾小球TGF-β1mRNA、STAT1 mRNA和STAT3 mRNA表达。4.补肾活血方剂治疗后对STNX大鼠的EMT及JAK/STAT信号途径的检测SD雄性大鼠随机分成3组:假手术组(A)、STNX组(B)和STNX+补肾活血方剂治疗组(C)。治疗组每日给予中药方剂20ml/kg灌胃。正常对照组和糖尿病组给予等量蒸馏水灌胃。于治疗后4、8、12周收集血、尿和肾组织。部分肾组织经4%多聚甲醛固定形态学观察和免疫组化。应用免疫组化、Western blot、免疫沉淀和Western blot以及RT-PCR等方法,观察对STNX大鼠肾小管上皮细胞JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3和p-STAT3蛋白及TGF-β1mRNA、STAT1 mRNA和STAT3 mRNA表达的影响。结果1. JAK/STAT信号途径对高糖诱导的EMT的影响①免疫荧光细胞化学显示,四种STAT信号蛋白在HKC细胞核和细胞浆均有表达。与低糖组比较,高糖组p-STAT1和p-STAT3表达增强,且增强部位为细胞核,提示活化后的STAT1和STAT3出现核转移。AG490处理组与高糖组相比,p-STAT1和p-STAT3的表达明显降低, STAT1和STAT3的核转移减少。②与低糖组相比,高糖组HKC细胞JAK2磷酸化明显增强(P <0.01)。AG490处理组JAK2磷酸化明显被抑制(P<0.01)。③Western blot显示,与同期低糖组相比,高糖组p-STAT1和p-STAT3表达明显上调(P <0.01)。AG490处理组p-STAT1和p-STAT3表达明显下调(P <0.01)。STAT1和STAT3在各组表达无明显差异。④免疫荧光细胞化学和western blot结果均显示:高糖组随刺激时间的延长,细胞内α-SMA的表达明显增强,E-Cadherin的表达明显减弱;与高糖组比较,AG490组细胞内α-SMA的表达明显降低,E-Cadherin表达明显升高。⑤TGF-β1 mRNA在低糖对照组有少量表达(0.21±0.04),在高糖组TGF-β1 mRNA表达明显上调(0.73±0.08),和对照组相比差异显著(P <0.01)。AG490处理组细胞TGF-β1 mRNA的表达明显降低(0.49±0.07,P <0.01)。⑥高糖刺激HKC的上清液中TGF-β1和Ⅰ型胶原分泌增加,与低糖对照组差异显著(P <0.01)。AG490处理组细胞TGF-β1和Ⅰ型胶原的分泌减少(与高糖组相比,P <0.01)。2.缬沙坦通过JAK/STAT途径对高糖诱导的EMT的影响①免疫沉淀和Western印迹显示,与低糖组相比,高糖组细胞JAK2磷酸化明显增强(P <0.01)。缬沙坦干预组JAK2的磷酸化水平明显降低(P <0.01)。②免疫荧光细胞化学和Western印迹结果显示,与高糖对照组比较,缬沙坦干预组STAT1和STAT3的核转移减少;p-STAT1和p-STAT3的表达显著下调。但非磷酸化STAT1和STAT3在各组表达无明显差异。③免疫荧光细胞化学及westernblot检测结果表明:与高糖对照组比较,缬沙坦组细胞内α-SMA的表达明显降低,E-cadherin表达明显升高。④RT-PCR显示,TGF-β1 mRNA在低糖对照组有少量表达(0.32±0.04),高糖组TGF-β1mRNA表达明显上调(0.76±0.09),和对照组相比差异有统计学意义;与高糖组相比,缬沙坦干预组TGF-β1 mRNA的表达明显降低(P <0.01),细胞上清液中TGF-β1和细胞外基质蛋白Ⅰ型胶原含量明显减少(P <0.01)。3. STNX大鼠肾脏的形态学改变、EMT及JAK/STAT信号蛋白的表达动物实验结果:①光镜下观察,STNX模型组大鼠4周时肾小球体积明显增大,近曲小管细胞水肿,部分细胞空泡变性。8周时部分肾小球代偿性肥大,肾小球内细胞数目增加,部分肾小球毛细血管囊萎陷、系膜基质增多;出现较明显的小管间质性损害,表现为小管扩张、小管细胞萎缩和空泡变性、小管基底膜增厚、间质细胞增多,出现炎症细胞浸润。12周时肾小球的萎缩、纤维化程度进一步加重;与之相比,肾间质的损伤更为明显,大量的近曲小管细胞萎缩,脱落。小管基底膜明显增厚,部分小管细胞向间质迁移,间质内胶原纤维增多,大量炎细胞浸润。②半定量RT-PCR和Western blot显示:与同期假手术组相比,STNX模型组大鼠肾小管细胞中TGF-β1mRNA、α-SMA的表达明显升高(P <0.05,P <0.01))。③半定量RT-PCR、免疫沉淀和Western blot结果显示,STAT1mRNA、STAT3mRNA和JAK2、STAT1、STAT3蛋白在假手术组有少量基础表达,不同时间表达无差异。STNX组第4、8、12周肾小管上皮细胞STAT1、STAT3 mRNA和相应蛋白的表达均明显高于假手术组(P均<0.05),而且磷酸化的相关蛋白表达随着时间延长增加更为明显。4.氯沙坦对STNX大鼠模型的EMT及JAK/STAT信号途径的影响STNX+20mg/Kg·d-1氯沙坦灌胃组大鼠与同期模型组相比,①肾小管细胞损伤、炎细胞浸润及间质纤维化程度明显减轻,α-SMA的表达明显减少(P <0.01),血中肌酐、尿素氮水平较同时期模型组明显下降(P均<0.05)。②与模型组相比,氯沙坦治疗组JAK2酪氨酸磷酸化水平下调, p-STAT1和p-STAT3表达明显下调(p-STAT1: STNX组3.28±0.19,氯沙坦治疗组1.79±0.24,P <0.01; p-STAT3: STNX组3.47±0.21,氯沙坦治疗组1.57±0.31 P<0.05),但JAK2、STAT1和STAT3蛋白表达无明显差异(P﹥0.05)。RT-PCR结果显示,假手术组大鼠肾小管细胞STAT1和STAT3 mRNA有少量基础表达。STNX组较假手术组STAT1和STAT3 mRNA表达明显上调(P <0.01)。氯沙坦治组STAT1和STAT3 mRNA表达轻度下调,但无统计学意义。TGF-β1mRNA在假手术组有少量基础表达,不同时间表达无差异。12周时STNX组TGF-β1 mRNA表达(0.48±0.09)明显上调(与假手术组比较P <0.01);与STNX组相比,氯沙坦干预组TGF-β1mRNA的表达明显降低(0.32±0.05,P <0.01)。5.补肾活血方剂对STNX的EMT及JAK/STAT信号途径的影响与同期模型组相比,补肾活血方剂治疗组肾小管细胞α-SMA的表达明显减少(P <0.05),损伤程度明显减轻,但仍存在部分肾小管细胞的空泡变性、萎缩及脱落,间质纤维组织增生及淋巴细胞、单核巨噬细胞的浸润;肾功能有明显地改善;24小时尿蛋白减少(P <0.05);②与模型组相比,补肾活血方剂治疗组p-JAK2水平下调(P <0.05),p-STAT1和p-STAT3表达明显下调(p-STAT1: STNX组2.56±0.19,补肾活血方剂治疗组1.76±0.14; p-STAT3: STNX组2.34±0.27,补肾活血方剂治疗组1.86±0.42 P均<0.05),JAK2、STAT1和STAT3蛋白表达与模型组相比无明显差异(P﹥0.05)。RT-PCR结果显示,假手术组大鼠肾小管细胞STAT1和STAT3 mRNA有少量基础表达。STNX组较假手术组STAT1和STAT3 mRNA表达明显上调(P <0.01)。与STNX组比较,补肾活血方剂治组STAT1和STAT3 mRNA表达下调(P <0.05);TGF-β1mRNA表达明显下调(P <0.01)。结论:①高糖能够刺激HKC细胞TGF-β1mRNA表达升高;α-SMA表达增强;细胞上清液中的TGF-β1、Ⅰ型胶原的分泌增多;表明高糖刺激能引起EMT的发生。与之同时,高糖还引起HKC细胞中信号蛋白JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化增强;提示高糖可诱导JAK/STAT信号途径的激活。JAK2特异性抑制剂AG490能够降低高糖刺激引起STAT1和STAT3的磷酸化,抑制细胞TGF-β1mRNA和α-SMA表达的升高,使上清中的TGF-β1、Ⅰ型胶原的含量减少。表明JAK/STAT信号途径参与了高糖诱导的EMT的发生。②缬沙坦在一定程度上抑制了JAK/STAT信号途径的活化,下调TGF-β1mRNA的表达,抑制高糖刺激引起的细胞TGF-β1及细胞外基质蛋白的分泌。提示缬沙坦的肾脏保护作用可能部分是通过抑制JAK/STAT信号途径实现的。③氯沙坦治疗能够明显抑制STNX大鼠肾小管细胞中的信号蛋白JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化,下调肾小管细胞TGF-β1mRNA的表达,抑制EMT的发生,减轻了肾小管细胞的损伤,延缓了肾功能衰竭的发生,其肾脏保护作用可能部分是通过影响JAK/STAT信号途径活化及EMT的进程而实现的。④补肾活血方剂能下调STNX大鼠肾小管细胞中STAT1和STAT3 mRNA的表达,明显抑制信号蛋白JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化,下调肾小管细胞TGF-β1mRNA的表达,明显减少肾小管细胞α-SMA的表达,抑制EMT的发生,减轻了肾小管细胞的损伤,在一定程度上保护了肾功能。其肾脏保护机制仍有待进一步研究。