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哺乳动物的生殖是一个十分复杂的生理学进程，受到一系列生殖因子的协同调控。PNX是近年来新发现的一种生殖肽，已有研究表明PNX通过调控GnRH和kisspeptin等关键生殖肽的表达从而影响动物个体的生殖进程。尽管如此，目前研究对PNX主要在下丘脑还是垂体水平调控生殖仍存在争议。值得注意的是，现有研究主要着眼于探索PNX多肽处理后的药理学作用，而内源性PNX保持生理水平对于哺乳动物的正常生殖发育过程是否起到决定性作用仍有待探究。此外，青春期是生殖系统发育的重要时期，现阶段研究仅仅局限于探究PNX对成年动物发情期的影响，尚未阐明PNX对青春期的影响。基于此，本研究采用慢病毒介导的RNAi技术沉默内源性PNX，并分别从细胞水平和动物水平对PNX的沉默效应进行探究，以进一步阐释PNX对生殖发育的调控机制。本文主要研究内容如下：
①慢病毒介导的PNX沉默细胞株的构建及检测
构建靶向PNX的RNAi慢病毒载体与阴性对照慢病毒载体，并采用三质粒包装系统生产慢病毒。随后利用慢病毒分别感染小鼠下丘脑GT1-7细胞及垂体LβT2细胞并通过嘌呤霉素进行筛选。结果表明：成功构建了靶向PNX的RNAi慢病毒载体与阴性对照载体，靶向PNX的RNAi慢病毒平均滴度为7.67×108TU/mL，阴性对照慢病毒平均滴度为8.66×108TU/mL，两种病毒滴度检测合格且无显著差异。利用慢病毒感染细胞后，成功筛选出下丘脑PNX沉默细胞株GT1-7-shPNX及垂体PNX沉默细胞株LβT2-shPNX。
通过荧光定量PCR与Western blot技术检测PNX沉默细胞株中重要生殖基因的表达，并结合回复实验排除RNA干扰技术可能存在的“脱靶效应”。结果表明：1）PNX沉默细胞株GT1-7-shPNX与LβT2-shPNX中PNX的mRNA水平和蛋白水平均显著下降，证实了靶向PNX的RNAi慢病毒的沉默效果；2）下丘脑PNX沉默细胞系GT1-7-shPNX中GnRH、GPR54基因的mRNA水平显著下调，而垂体PNX沉默细胞系LβT2-shPNX中LH、FSH等生殖基因的表达无显著性差异；3）通过回复实验排除了“脱靶效应”可能导致的假阳性。上述结果证实内源性PNX沉默能够抑制下丘脑而非垂体水平细胞中重要生殖基因的表达，表明内源性PNX可能主要在下丘脑水平对生殖发育过程进行调控。
②慢病毒介导的PNX沉默对雌性小鼠青春期发育的影响
前文研究已证实了内源性PNX沉默在下丘脑水平对生殖基因的抑制作用。为进一步探究内源性PNX沉默对青春期发育的影响，本研究以青春期前期雌性小鼠作为研究对象，侧脑室注射靶向PNX的RNAi慢病毒颗粒后，检测小鼠下丘脑生殖基因表达、青春期启动时间、子宫卵巢发育等生殖发育情况。结果表明：1）靶向PNX的RNAi慢病毒注射导致小鼠下丘脑中PNX的蛋白及mRNA水平显著下调，表明下丘脑中PNX受到显著性沉默；2）PNX沉默显著延迟了小鼠阴道初次开口时间，降低了小鼠子宫卵巢器官指数，同时，形态学分析结果显示PNX沉默显著降低了小鼠子宫内膜厚度及卵巢窦状卵泡的数量。这表明内源性PNX沉默会延缓青春期启动并抑制性腺发育；3）PNX沉默显著抑制了下丘脑中GnRH、kiss1、GPR54基因的mRNA水平；4）PNX沉默导致小鼠血清中GnRH的激素水平降低，同时下调了LH、FSH及雌激素的激素水平。综上，PNX沉默能够在下丘脑水平抑制GnRH的合成与分泌，从而抑制垂体LH、FSH的合成与分泌，进而抑制雌性小鼠的青春期发育过程。
本研究从细胞水平和动物水平证实内源性PNX沉默能够通过抑制下丘脑GnRH的合成与分泌，从而干扰下丘脑-垂体-性腺轴的内分泌环境，最终抑制青春期启动与生殖发育过程。本研究为进一步阐明PNX在哺乳动物中的生殖调控机制奠定了基础，有助于进一步理解人类的生殖发育过程，同时为生殖疾病治疗等方面提供理论依据。
①慢病毒介导的PNX沉默细胞株的构建及检测
构建靶向PNX的RNAi慢病毒载体与阴性对照慢病毒载体，并采用三质粒包装系统生产慢病毒。随后利用慢病毒分别感染小鼠下丘脑GT1-7细胞及垂体LβT2细胞并通过嘌呤霉素进行筛选。结果表明：成功构建了靶向PNX的RNAi慢病毒载体与阴性对照载体，靶向PNX的RNAi慢病毒平均滴度为7.67×108TU/mL，阴性对照慢病毒平均滴度为8.66×108TU/mL，两种病毒滴度检测合格且无显著差异。利用慢病毒感染细胞后，成功筛选出下丘脑PNX沉默细胞株GT1-7-shPNX及垂体PNX沉默细胞株LβT2-shPNX。
通过荧光定量PCR与Western blot技术检测PNX沉默细胞株中重要生殖基因的表达，并结合回复实验排除RNA干扰技术可能存在的“脱靶效应”。结果表明：1）PNX沉默细胞株GT1-7-shPNX与LβT2-shPNX中PNX的mRNA水平和蛋白水平均显著下降，证实了靶向PNX的RNAi慢病毒的沉默效果；2）下丘脑PNX沉默细胞系GT1-7-shPNX中GnRH、GPR54基因的mRNA水平显著下调，而垂体PNX沉默细胞系LβT2-shPNX中LH、FSH等生殖基因的表达无显著性差异；3）通过回复实验排除了“脱靶效应”可能导致的假阳性。上述结果证实内源性PNX沉默能够抑制下丘脑而非垂体水平细胞中重要生殖基因的表达，表明内源性PNX可能主要在下丘脑水平对生殖发育过程进行调控。
②慢病毒介导的PNX沉默对雌性小鼠青春期发育的影响
前文研究已证实了内源性PNX沉默在下丘脑水平对生殖基因的抑制作用。为进一步探究内源性PNX沉默对青春期发育的影响，本研究以青春期前期雌性小鼠作为研究对象，侧脑室注射靶向PNX的RNAi慢病毒颗粒后，检测小鼠下丘脑生殖基因表达、青春期启动时间、子宫卵巢发育等生殖发育情况。结果表明：1）靶向PNX的RNAi慢病毒注射导致小鼠下丘脑中PNX的蛋白及mRNA水平显著下调，表明下丘脑中PNX受到显著性沉默；2）PNX沉默显著延迟了小鼠阴道初次开口时间，降低了小鼠子宫卵巢器官指数，同时，形态学分析结果显示PNX沉默显著降低了小鼠子宫内膜厚度及卵巢窦状卵泡的数量。这表明内源性PNX沉默会延缓青春期启动并抑制性腺发育；3）PNX沉默显著抑制了下丘脑中GnRH、kiss1、GPR54基因的mRNA水平；4）PNX沉默导致小鼠血清中GnRH的激素水平降低，同时下调了LH、FSH及雌激素的激素水平。综上，PNX沉默能够在下丘脑水平抑制GnRH的合成与分泌，从而抑制垂体LH、FSH的合成与分泌，进而抑制雌性小鼠的青春期发育过程。
本研究从细胞水平和动物水平证实内源性PNX沉默能够通过抑制下丘脑GnRH的合成与分泌，从而干扰下丘脑-垂体-性腺轴的内分泌环境，最终抑制青春期启动与生殖发育过程。本研究为进一步阐明PNX在哺乳动物中的生殖调控机制奠定了基础，有助于进一步理解人类的生殖发育过程，同时为生殖疾病治疗等方面提供理论依据。