目前血管移植术在临床上已广泛应用于各种心血管疾病的外科治疗。在血管移植中,大隐静脉是冠状动脉搭桥及周围血管手术常用的移植材料,而动脉移植多用于动脉感染时,其长期通畅率比静脉移植要高。自体新鲜血管是理想的移植材料,但是来源有限。目前临床上常用的人造血管有Dacron,ePTFE等,但是由于人造血管内表面没有内皮细胞覆盖,所以容易形成血栓,长期通畅率低下,而且人造血管植入机体后没有生物活性,无法被机体降解。　　 20世纪90年代后期,进一步提出血管组织工程的新概念,体现了组织工程的发展方向。在血管组织工程研究中,重建内皮细胞功能成为主要研究方向。内皮细胞(EC)具有抗凝、调节血管张力、识别各种理化信号、调控细胞增殖等重要功能,现在可以通过多种途径获得EC,如血管、网膜组织、皮下脂肪等。获取细胞常用胶原酶和(或)胰蛋白酶进行酶解,获得活细胞的数目同酶浓度和酶解时间相关。血管来源包括颈静脉、大隐静脉、前臂静脉及不影响组织血供的外周动脉。由于传统的组织工程是以成体细胞体外扩增作为种子细胞,但实际应用中内皮细胞体外培养生长缓慢,且传代5～8代后迅速发生衰老,直接影响细胞种植后功能体现。同时由于培养时间较短(1d～1w),可能难以建立正确的细胞连接和信号传递途径,无法充分体现内皮细胞的调节功能。随着近年来对干细胞的研究进展,将干细胞作为种子细胞为组织工程的发展提供了新机遇,干细胞来源的血管内皮细胞作为种子细胞在组织工程中的应用成为热点研究课题。本研究将犬骨髓源内皮祖细胞在体外增殖培养后,作为种子细胞种植到经肝素固化后的脱细胞犬颈动脉血管支架上,从而构建组织工程血管,进而再移植到提取干细胞的犬体内,尝试一种全新的血管代用品。　　 全文分为五个部分:　　 第一部分、犬颈动脉脱细胞血管支架的制备　　 目的:探讨组织工程血管脱细胞血管支架的制备及其免疫原性的检测方法。　　 方法:取普通杂种犬的颈动脉,剪成5.0cm长的血管段,随机分为3组(每组5段):对照组1、对照组2、脱细胞组。对照组1:TBS冲洗后直接用Bouin液固定12h,石蜡包埋。对照组2:TBS4℃浸2h,1％TritonX-1004℃持续震荡12h。脱细胞组:TBS4℃浸2h,1％TritonX-1004℃持续震荡12h,0.125％胰酶37℃消化12h,按1:1比例用0.5mg/ml DNA酶和0.5mg/ml RNA酶37℃消化12h,TBS洗3次。行HE、Masson、VG染色,光镜及扫描、透射电镜观察血管内皮细胞、平滑肌细胞的脱落情况,以及血管弹力纤维、胶原纤维连续性是否完好,有无中断、消失,胶原纤维横纹是否消失,有无细胞结构或细胞碎片残留。免疫组化方法检测血管脱细胞处理前后主要组织相容性复合体I(MHCI)的变化情况,并将检测结果作图像分析。　　 结果:犬颈动脉脱细胞血管支架较新鲜动脉更为白色,半透明,质地柔软,顺应性良好。对照组1光镜及扫描、透射电镜见动脉结构完整,各层细胞结构清晰,Masson、VG染色见弹力纤维、胶原纤维连续性完好,纤维结构间被细胞占据,无空白区。对照组2见残留多量细胞及其碎片成分,纤维结构完整,无中断、消失。脱细胞组未见细胞及其碎片成分,各层结构清晰可辨,纤维网架结构保持完整,弹力纤维卷曲呈波浪状,排列整齐、致密,无断裂,胶原纤维连续性好,横纹存在,原来内皮细胞、平滑肌细胞占据的地方变成纤维间的空白区。免疫组化实验发现对照组1血管内皮细胞及平滑肌细胞高度表达MHCI,阳性反应见于血管内膜和中膜,呈细胞形态分布;对照组2内皮细胞层已无细胞,未见免疫组化阳性反应,中膜虽已无平滑肌细胞,但仍有浅淡免疫组化染色,不呈细胞形态,呈小碎片散在分布,且阳性染色面积较对照组1明显减少;脱细胞组的阳性反应更少,只在中膜胶原纤维间有很少量免疫组化染色。图像分析得出阳性颗粒面积与视场面积比:对照组1为(24.09±6.09)％,对照组2为(6.71±2.18)％,脱细胞组为(1.62±0.76)％,经方差分析各组间比较均有显著差异(P＜0.01)。　　 结论:通过TritonX-100、胰酶以及DNA酶、RNA酶可以在体外制备脱细胞血管支架。MHCI免疫组化染色能很好地反映血管脱细胞处理前后免疫原性强弱变化,可作为检测血管脱细胞支架免疫原性的实验方法之一。　　 第二部分、脱细胞支架的表面肝素固化　　 目的:通过对脱细胞血管支架的表面进行肝素固化,制备一种具有抗凝功能的组织工程血管支架。　　 方法:将肝素分子通过共价键结合至犬颈动脉的脱细胞支架表面,甲苯胺蓝滴定法测定结合的肝素量;HE染色及电镜观察其形态特征:体外凝血时间测定及血小板黏附试验评价其抗凝血性能;细胞接触实验及MTT法检测肝素固化支架体外的细胞生物毒性。　　 结果:经肝素固化的脱细胞基质细胞成分去除完全,而细胞外基质保留完整,物理性能与新鲜动脉相似,体外抗凝试验显示有良好的抗凝血性能;细胞接触实验未显示肝素固化支架有明显的细胞毒性,且与未处理脱细胞支架相比,能促进表面平滑肌细胞的增殖。　　 结论:对同种异体脱细胞血管支架进行表面肝素固化,可获得一种具有良好血液相容性的小口径组织工程血管支架。　　 第三部分、犬骨髓源EPCs体外分离、培养及鉴定　　 目的:建立犬骨髓源内皮祖细胞(EPCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为EPCs进一步作为种子细胞参与体外构建组织工程血管奠定基础。　　 方法:抽取犬髂后上棘、髂前上棘骨髓,密度梯度离心,淋巴细胞分离液ficoll分离骨髓,得到骨髓单个核细胞悬液,采用EGM-2MV培养液置于预先Fn铺板的培养瓶中;倒置相差显微镜观察细胞形态,并绘制生长曲线;通过Dil-ac-LDL及UEA-I摄取实验检测EPCs的功能;在培养不同时间点,进行flk-1,CD133和VIII因子相关抗体免疫组化检测,并以内皮细胞和骨髓单个核干细胞作为对照;采用流式细胞仪检测CD133,VEGFR-2的表达。　　 结果:呈集落样生长的贴壁细胞平均10天汇合,每毫升骨髓可获得大约(1.3±0.3)×106个细胞,外观呈鹅卵石样,能摄取Dil-ac-LDL和UEA-I,flk-1,CD133和VIII因子相关抗体免疫组化检测均呈阳性,流式细胞仪示EPCs培养10天后VEGFR-2和CD133双阳性细胞扩增达33倍。　　 结论:密度梯度离心结合贴壁分离培养法,以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓源EPCs,分离培养的细胞具有EPCs的基本表型和特性,而且体外增殖活跃。能够满足体外构建组织工程血管的需要。　　 第四部分、体外动态培养构建组织工程血管　　 目的:探讨骨髓源内皮祖细胞复合脱细胞血管支架体外构建组织工程血管的可行性。　　 方法:将培养的2～3代犬EPCs用0.125％胰酶消化,收集细胞,CM-DiI标记后制成细胞悬液,细胞密度调整至5×106/ml,注入脱细胞支架静置4h后翻转90°,再注入等量细胞,重复4次。之后将支架转到自制的动态反应器中培养,隔天更换培养液。分别在血管培养1、4、8d时,取小段血管组织进行光镜、电镜观察EPCs在脱细胞支架上的黏附及生长情况;激光共聚焦荧光显微镜下观察血管组织切片能否见到CM-DiI染色阳性(发红色荧光)细胞黏附及生长。取组织工程血管组、脱细胞血管支架组及新鲜颈动脉组血管,分别裁剪成1.0cm×0.5cm大小相同的血管条,用生物力学测定仪给予单轴负荷,检测其在不同径向应力下的应变情况,并绘制径向应力应变曲线;同时,取长为1.0cm的各组血管,利用生物力学测定仪给予纵向拉力直到血管断裂,测定最大断裂强度。　　 结果:组织工程血管培养过程中,第1d时见EPCs细胞黏附在脱细胞血管支架上,第2d见细胞开始增殖。第2d、第4d时细胞增殖明显增多,但分布不均。第4d还可见细胞向中膜层迁移;第8d可见细胞大量生长,沿血管壁内外多层排列,均处于旺盛的分泌状态,细胞亚微结构与正常细胞结构相似,细胞排列方向与反应器流体方向高度一致。激光共聚焦荧光显微镜下组织工程血管能见到CM-DiI染色阳性细胞。应力应变曲线提示;随着各组血管条单轴负荷的逐渐增加,组织工程血管、脱细胞支架、正常生理血管的径向应力应变曲线不相吻合,组织工程血管组与脱细胞支架组有显著性差异(P＜0.05),而组织工程血管组与正常生理血管组无显著性差异(P＞0.05)。最大断裂强度测试发现组织工程血管组与脱细胞支架组有显著性差异(P＜0.05),而组织工程血管组与正常生理血管组无显著性差异(P＞0.05)。　　 结论:犬骨髓源内皮祖细胞复合脱细胞血管支架可于体外成功构建组织工程血管,而且与犬自身动脉有着极其相似的顺应性,有望成为一种全新的血管代用品。　　 第五部分、组织工程血管的动物体内移植实验　　 目的:建立犬颈(股)动脉移植的动物模型,观察经体外构建的组织工程血管在移植后的组织形态学变化、内皮细胞覆盖情况及通畅率等。　　 方法:将经体外构建的组织工程血管移植入所抽取骨髓的对应犬体内并设立对照组移植组。术后每月进行彩色多普勒超声检查,观察通畅及狭窄情况。各实验动物于移植后第6月,在DSA下行双侧颈动脉及股动脉造影,证实通畅情况。随后取出移植段动脉标本,进行病理学检测。　　 结果:移植术后6月,3组所有移植血管均未见明显感染灶或假性动脉瘤形成。组织工程血管组17例通畅,闭塞3例可见吻合口处薄层附壁血栓形成;自体静脉组18例通畅,其内壁光滑,管壁增厚伴钙化,其中3例有微小的真性动脉瘤形成;脱细胞血管支架组,仅5例通畅,余15例闭塞,其管壁僵硬,腔内多为陈旧性血栓,主要集中于两侧吻合口处。光镜及电镜检测发现自体静脉组血管内表面被内皮细胞覆盖,但是内皮细胞排列尚凌乱,形状欠规则,内膜明显增生;脱细胞支架组的动脉内壁有明显附壁血栓;而组织工程血管组可见内皮完全覆盖内表面,形态规整,排列方向与血流方向一致,无明显内膜增生。免疫组化显示,组织工程血管内膜覆盖细胞呈vWF阳性,排列致密、规整,为血管内皮细胞,血管壁间大量细胞呈α-SMA阳性,散在排列,为平滑肌细胞。激光共聚焦荧光显微镜下观察,组织工程血管移植腔内表面仍可见CM-DiI染色阳性细胞,发红光,但细胞数少于植入前。此外,血管壁内也有少数CM-DiI染色阳性细胞;进行vW因子免疫荧光检测发现,vW因子阳性细胞已完全覆盖血管内表面,细胞浆发绿色荧光,且部分vW因子阳性细胞同时表现CM-DiI染色阳性发黄光,提示EPCs已分化为内皮细胞。　　 结论:脱细胞支架组复合EPCs构建的组织工程血管生物相容性好,EPCs在兔体内局部微环境的诱导下可以分化为内皮细胞。移植到受体需要血管重建的部位后通畅率高,有望作为新一代血管代用品。