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糖苷水解酶（Glycoside hydrolases,GH,EC3.2.1）,是一类水解糖苷键的酶,它以内切或外切方式水解各种含糖化合物（包括单糖苷、寡糖、多糖、皂甙和糖蛋白等）中的糖苷键,生成单糖、寡糖或糖复合物。其GH3家族广泛分布于细菌、真菌和植物中,多具有广泛的底物特异性,有的是双功能或多功能酶。在生产生物活性苷元如白藜芦醇和宝霍苷I、转化木质纤维素、合成寡糖及糖复合物等方面具有应用潜力。在本实验室前期研究中发现鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）微生物拥有大量具有水解带有苯环和杂环配体糖苷的糖苷水解酶,因此本研究对鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.ATCC 31555菌株中编码糖苷水解酶的基因进行挖掘,将其中五个基因（Sp BGL1、2、3、4、5）克隆到外源载体,在E.coli中实现重组表达,并对酶蛋白进行底物谱分析。鉴定Sp BGL1为具有β-葡萄糖苷酶活性的β-木糖苷酶、Sp BGL2为β-葡萄糖苷酶、Sp BGL3为β-木糖苷酶。以pNPG和p NP-Xyl为底物分别对Sp BGL2、Sp BGL1和Sp BGL3进行了酶学性质的研究。结果表明,Sp BGL1以p NP-Xyl为底物的最适反应p H和温度分别为6.0和50℃,Km为2.752±0.316 m M,Vmax为8.082±0.297μmol·min-1mg-1。Sp BGL1在p H 5.5-6.5,以及25-35℃范围内显示了较好的稳定性,在25℃下保存6 h酶活基本没有改变,室温的稳定性较好。Sp BGL1的木糖抑制常数Ki为175.264±6.105、葡萄糖抑制常数Ki为110.6±5.563 m M。Sp BGL1对多种芳香类糖苷底物具有水解作用,其中对p NPX的活力最高,pNPG次之,还对p NP-β-D-吡喃甘露糖苷具有较高的水解活性。Sp BGL1对多种醇类都表现出较好的耐受性,在含15%的甲醇、乙醇环境中,Sp BGL1还能够分别保持60.1%和90.9%的酶活力以pNPG为底物,Sp BGL2的最适反应p H和温度分别为6.0和45℃,Km为4.06±0.53 m M,Vmax为38.35±1.92μmol·min-1mg-1。Sp BGL2在p H5.0-6.0,及30℃以下的范围内显示了较好的稳定性。Sp BGL2对葡萄糖较敏感,葡萄糖抑制常数Ki仅为3.161 m M。在水解作用上,Sp BGL2对pNPG的活力最高,p NP-β-D-纤维二糖次之,还对4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷、邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、苦杏仁苷、纤维二糖和龙胆二糖存在微弱的水解作用。Triton X-100（1%,v/v）、β-mercaptoethanol（1%,v/v）和Tween80（5%,v/v）对Sp BGL2有激活作用,分别刺激Sp BGL2的活力到对照活力的130%、121%和141%。以p NP-Xyl为底物,Sp BGL3的最适反应p H和温度分别为5.5和40℃,Km为12.85±5.72 m M,Vmax为3.165±0.703μmol·min-1mg-1。Sp BGL3对木糖的耐受性非常好,在1 M木糖浓度下酶活力仍有77%。但Sp BGL3的稳定性较差,当温度超过30℃,1 h后仅剩不到30%的活力。Sp BGL3仅对p NP-Xyl表现出水解活性,对所检测的天然糖苷和二糖类底物均无水解活性。Sp BGL3对所检测的大部分化学试剂的耐受性较好,除SDS（10 m M）完全抑制Sp BGL3的活性外。Triton X-100（1%,v/v）、β-mercaptoethanol（1%,v/v）和Tween 80（5%,v/v）对Sp BGL3有激活作用,Imidazole（10 m M）对Sp BGL3的活性基本没有影响。对Sp BGL1和Sp BGL2的转糖苷活性研究显示,Sp BGL1对α-乳糖、D-木糖、麦芽糖、异麦芽糖具有转糖苷活性。同时,Sp BGL1对甜茶苷具有转糖苷功能,能够催化生成一种新的转糖苷产物。Sp BGL2对α-乳糖、D-半乳糖、D-木糖、D-果糖、山梨醇、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、丙三醇等化合物具有转糖苷活性。在水解功能研究中,发现Sp BGL2能够水解黄豆黄酮、淫羊藿黄酮、虎杖苷,但水解反应所需的时间较长。Sp BGL1能够水解人参皂苷中Fc、黄豆黄酮、淫羊藿黄酮、虎杖苷等底物,其中对虎杖苷的水解表现最好。同时,针对Sp BGL1能高效转化虎杖苷生产白藜芦醇这一特点,本研究设计并优化了双相酶法系统用于配合Sp BGL1水解虎杖苷粗提物生成白藜芦醇。180μg/m L Sp BGL1在3 m L的双相酶解体系中水解30g/L 20%虎杖苷粗提物,获得白藜芦醇的产量为3.34 g/L。该结果验证了双相酶法在水解底物粗提物中的优势和应用潜力。本研究通过Alpha Fold 2对Sp BGL1、Sp BGL2和Sp BGL3的蛋白质3D结构进行预测和结构域比较研究,发现Fn3＿like结构域的空间结构在三个蛋白中非常保守,但其功能未知。同时,Fn3＿like结构域参与形成了Sp BGL1上的一个夹子状潜在口袋。以预测的蛋白3D结构为模型,分析参与Sp BGL1与虎杖苷分子相互作用的区域及氨基酸位点。本研究构建了一套可用于筛查突变体酶水解虎杖苷能力的高通量筛选体系,对Sp BGL1夹子状潜在口袋内的5个与虎杖苷结合相关潜在位点D765、Y657/N658、E292、Y136和Y416的饱和突变体变体库进行筛查。结合七叶苷酶活筛选方法,挑选突变体库内酶活和虎杖苷水解能力有变化的突变体酶进行检测分析,结果表明D765、Y657和N658对Sp BGL1的酶活和虎杖苷水解功能有明显的影响。说明Fn3＿like结构域很可能参与酶对底物的结合,并进而以此调控蛋白的构象,使酶蛋白的催化口袋更好地与底物结合、催化水解反应,而Fn3＿like结构域参与形成的空间结构（潜在口袋）可能是触发变构的关键。