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贝壳杉烯氧化酶KO和贝壳杉烯酸氧化酶KAO是赤霉素生物合成过程中重要的限速酶，近几年来，越来越多的物种对这两种编码酶基因进行克隆和功能验证，如拟南芥、水稻、小立碗藓等，但柑橘中研究甚微。为了研究并验证柑橘中这两种酶功能，本研究分离了纽荷尔脐橙的内-贝壳杉烯氧化酶CsKO、内-贝壳杉烯酸氧化酶KAO和其自身的NADPH-细胞色素还原酶CsCPR，通过利用毕赤酵母X-33共表达的方式来验证这两种编码酶基因的功能。主要研究结果有: 1.从纽荷尔脐橙成熟叶片中分离并克隆了纽荷尔脐橙NADPH细胞色素还原酶编码基因CsCPR，该基因CDS全长2148bp，编码715个氨基酸，预测分子量和等电点分别为79.2kDa和5.32，与可可和杨树CPR基因序列比对发现与它们的同源率可分别达到83％和82％。CsCPR可在NADPH存在条件下还原氧化型细胞色素C，使A550值发生改变。 2.利用电转化和LiCl化学转化法获得了同一载体两种基因和不同抗性载体不同基因的双转化子，并对转化方法和阳性克隆选择方法进行了选择和优化，发现同种抗性载体的双转化子可以通过电转化方式获得，而不同抗性载体的双转化子需利用化学转化法获得。 3.优化了毕赤酵母表达P450单氧化酶蛋白的表达条件，经过对不同表达条件下的蛋白总含量和微粒体中P450蛋白含量，得到在诱导表达4天、pH=5、甲醇浓度为0.75％是蛋白表达量最高，还对其它表达条件进行了正交实验分析，结果发现这些因素的对蛋白表达的影响力度:温度＞BMGY∶BMMY培养基置换比＞YNB含量＞甲醇浓度。 4.用不同的底物与这两种酶反应，GC-MS分析反应产物验证它们的功能，结果发现共表达条件下，毕赤酵母双转化子中CsKO可以催化贝壳杉烯或贝壳杉烯醇到贝壳杉烯酸的氧化反应，这里的贝壳杉烯既可以使标准品也可以是日本柳杉挥发油中的贝壳杉烯。双转化子中的CsKAO也可以催化贝壳杉烯酸或GA12-醛到GA12的氧化反应。