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糖尿病是一种以代谢障碍、高血糖为特征,由遗传与环境长期共同作用所导致的全身性代谢内分泌疾病,对人类的生命与健康造成了严重影响,并且糖尿病患者的数量呈现出不断上升的趋势,因此,研发有效且低毒的抗糖尿病治疗药物具有重要意义。无论是自身因素还是环境因素导致的糖尿病,基本都会通过胰岛素分泌能力的损伤或胰岛素抵抗两种病理过程,最终导致机体糖代谢失衡及高血糖。其中胰岛素抵抗现象主要存在于脂肪、骨骼肌等对胰岛素敏感的组织。在骨骼肌和脂肪组织中葡萄糖的转运主要是由葡萄糖转运子4(glucose transporter 4,GLUT4)负责。与正常人相比,患有2型糖尿病的患者体内的骨骼肌细胞和脂肪细胞中被检出的GLUT4蛋白和mRNA含量明显低于正常值,由此可以看出GLUT4蛋白合成和基因转录异常是造成胰岛素抵抗现象的主要原因之一。鉴于此,我们以GLUT4为治疗糖尿病的一个潜在的分子靶点,来筛选有效的治疗糖尿病的化合物,本研究的主要实验方法及结果如下:首先,我们以GLUT4为靶点构建了由GLUT4启动子驱动的荧光素酶报告载体。利用PCR技术扩增出1929bp的GLUT4启动子序列,并将其与pGL3-basic载体连接,以此构建荧光素酶报告载体pGL3-GLUT4。通过荧光素酶活性检测,证实GLUT4启动子具有较高的活性,这说明我们所钓取的GLUT4启动子片段具有较高转录活性,因此pGL3-GLUT4可用于后续化合物的筛选实验。其次,我们从天然化合物中筛选了GLUT4的表达促进剂。通过采取荧光素酶报告基因活性检测法,对本实验室中300多种天然化合物进行了筛选。经初筛和复筛实验发现,化合物TI432对GLUT4启动子的活性有较为明显的促进作用。进一步利用蛋白免疫印迹分析实验从蛋白水平证实TI432确实增强了GLUT4蛋白的表达。然后,我们探究了候选化合物TI432调控GLUT4表达的分子机制。在调控GLUT4转录表达中,AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路和肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)转录因子起到重要作用。因此,我们探究了TI432对AMPK信号通路和MEF2转录因子活性的影响。结果显示,TI432上调了细胞中AMPK的磷酸化水平并促进了MEF2的转录因子活性。以上结果表明,TI432很可能通过增强AMPK信号通路及MEF2的转录因子活性,从而发挥促进GLUT4表达的作用。最后,我们探究了TI432作为GLUT4的表达促进剂是否会影响胰岛素诱导的细胞对葡萄糖的吸收和利用。因此,我们利用2-脱氧葡萄糖(2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diaxol-4-yl)amino]-2-deoxyglucose,2-NBDG)荧光探针检测了TI432对胰岛素诱导的HepG2细胞和L6细胞吸收利用葡萄糖能力的影响,发现在胰岛素刺激作用下TI432可增强以上细胞对葡萄糖摄取的能力。综上所述,本研究提供了一种有效的以GLUT4为靶点筛选抗糖尿病药物的模型,并利用该模型发现天然化合物TI432能够促进GLUT4的表达并增强胰岛素诱导的HepG2细胞和L6细胞对葡萄糖的吸收利用能力,这为将来将天然产物化合物TI432开发为治疗糖尿病的药物提供了理论及实验依据。