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目的:纯钛因具有低密度、高比强度、优异的抗腐蚀性、生物相容性好、无磁性、无毒性等各种优良特性,已成为应用最广泛的种植体植入材料之一。但纯钛作为生物惰性材料本身无抗菌性,因此容易导致局部的细菌繁殖,细菌容易在种植体颈部等区域黏附引起种植体周围炎而影响其骨结合能力。因此,提高种植体长期的抗菌活性变得尤为重要。虽然已有研究报道通过种植体表面改性,如表面涂层携有抗生素等方法能够抑制种植体植入后细菌感染,减少种植体周围炎的发生。但因涂层面积有限,抗菌活性物质结合效果差,负载能力有限,易分解丢失等问题影响种植体表面涂层的应用。因此,使钛植入物具有整体长效的抗菌性能,提高纯钛表面的生物活性,提高早期骨整合能力,将对有效地降低植入物植入后细菌感染的发生率,改善患者生活质量具有重大的意义。铜具有高效的、持久的广谱抗菌性能,是人体必须的微量元素,可发挥预防骨质疏松症,促进成骨分化的作用。本团队的前期研究表明,在钛合金中添加质量分数5%的铜可有效地杀灭金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等常见致病菌。同时,阳极氧化技术操作简便、成本低廉、易于控制,已成为改变钛及钛合金表面形貌并增强其成骨性能的高效途径之一。阳极氧化不仅能增强纯钛种植体的耐磨性和耐腐蚀性能,还能形成具有微米-纳米级孔洞结构的表面形貌。前期实验研究结果表明Ti-Cu合金具有良好的抗菌性能、耐蚀性能、优异的生物相容性及促成骨能力,作为种植体材料具有良好的应用前景。基于以上,我们首次利用阳极氧化技术对不同铜含量的钛铜合金进行表面改性,并对三种不同铜含量Ti-x Cu（x=3,5,7 wt%）合金的材料学性能、生物相容性、抗菌性能和体内安全性进行全面的研究分析和评价,筛选出抗菌性能、促成骨能力及生物相容性等综合性能最佳的新型表面改性钛铜合金。同时,我们制备了纯Ti和最优化铜含量的Ti-5Cu合金种植体,在比格犬下颌前磨牙处植入种植体3个月,观察Ti和Ti-5Cu合金体内骨结合情况和促成骨能力,为表面改性Ti-5Cu合金的临床应用提供实验基础。研究方法:首先进行不同铜含量钛铜合金材料制备并进行表面改性处理。从材料的物理性能、体外抗菌实验、体外细胞实验和体内动物植入实验等多方面对合金进行材料学及生物学性能综合评价。材料制备:Ti-x Cu（x=3,5,7 wt%）合金由真空自耗熔炉中电弧熔化纯钛和纯铜产生。将铸锭在740℃下进行热处理,空冷至室温。对照组选取商业二级纯钛。将材料切割成直径10毫米,厚度2毫米的圆片,碳化硅砂纸逐级机械打磨至#2000。将实验组钛铜合金放入3%氢氟酸溶液中进行阳极氧化,得到阳极氧化+HF酸蚀Ti-3Cu合金（简称Ti-3Cu）;阳极氧化+HF酸蚀Ti-5Cu合金（简称Ti-5Cu）及阳极氧化+HF酸蚀Ti-7Cu合金（简称Ti-7Cu）。对照组纯钛经过氧化铝颗粒喷砂后酸蚀处理,获得喷砂酸蚀纯钛（简称Ti）。材料性能研究:通过激光共聚焦扫描电子显微镜对材料的表面形貌进行观察和分析,计算材料表面粗糙度参数。同时,对样品的微米/纳米表面及合金的截面显微结构进行深入地评估分析。根据ISO 10993-12国际标准,将Ti-x Cu（x=3,5,7 wt%）合金浸泡于生理盐水中,在37℃条件下分别浸泡1、3、7、14、21、28天后,通过电感耦合等离子体质谱仪测量溶液中铜离子的含量,并通过外形图像分析法测量材料表面的润湿性。通过图像计算接触角,比较不同合金接触角的变化及材料的亲疏水性能。体外抗菌实验:选取金黄色葡萄球菌为实验菌株,以纯钛为对照评价Ti-x Cu（x=3,5,7 wt%）合金的抗菌活性。从定量抗菌试验、生物膜观察和细菌形态学检查三个方面研究了钛铜合金的杀菌率、对细菌形态变化的影响和细菌生物膜形成情况。将金黄色葡萄球菌与Ti-3Cu,Ti-5Cu,Ti-7Cu和Ti在37℃下共培养24小时,通过涂布琼脂平板计数黏附于材料表面和游离于周围培养基中的活菌,计算抗菌率。通过LIVE/DEAD（?）Bac Light TM Viability Kits L7012试剂盒检测细菌活力,激光共聚焦扫描电子显微镜观察、拍照。采用DAPI,SYPRO橘色染色剂和Con A依次对细菌生物膜进行染色,激光共聚焦扫描电子显微镜观察并进行三维重建分析。扫描电子显微镜观察与不同材料共孵育后金黄色葡萄球菌形态的变化。通过透射电镜检测Ti-x Cu（x=3,5,7 wt%）合金对细菌内部微观结构的改变,深入分析实验材料的抗菌机制。体外细胞实验:通过MC3T3-E1细胞增殖、黏附、凋亡实验,考察不同铜含量钛铜合金的生物相容性;通过检测细胞的ALP活性和相关成骨因子的表达检测Ti-x Cu（x=3,5,7 wt%）合金的促成骨性能。体外培养MC3T3-E1细胞,将灭菌后的Ti-3Cu,Ti-5Cu,Ti-7Cu和Ti与MC3T3-E1细胞共培养,CCK-8实验测定细胞相对增殖率,判定材料的细胞毒性级别。将Ti-3Cu,Ti-5Cu,Ti-7Cu和Ti与细胞共培养4小时和24小时后,用罗丹明标记的鬼笔环肽和DAPI双染,荧光显微镜观察MC3T3-E1细胞在材料表面的黏附情况及细胞骨架结构变化。FITC/PI双染法测定细胞与材料共孵育3天和7天时细胞的凋亡情况,测定细胞的早期凋亡率。碱性磷酸酶测定试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒测定3天和7天的细胞碱性磷酸酶活性。RT-q PCR实验测定3天和7天的细胞中与细胞成骨相关基因Runx2,OPN和Collagen I的m RNA表达水平。体内植入实验:全身麻醉条件下,拔除比格犬双侧下颌第一至第四前磨牙。自然愈合3月后,在每只动物单侧下颌骨植入2颗Ti-5Cu种植体,在对侧下颌骨的相同部位,植入2颗相同尺寸的Ti种植体。植入后定期检查植入情况。植入后3个月,安乐死动物,并对植入部位进行大体观察,X射线观察,Micro-CT检测和亚甲基蓝-酸性品红染色实验等。结果:材料性能评价:Ti-3Cu,Ti-5Cu和Ti-7Cu合金中实际Cu成分为3wt.%,4.82wt.%和6.6wt.%。经过表面改性处理的Ti-3Cu,Ti-5Cu和Ti-7Cu合金表面形成均匀分布的多层次凹坑状空腔,空腔的底部有明显大小不一的微孔,直径从500纳米到2微米不等。激光共聚焦扫描电镜结合三维表面重建发现,四组材料平均粗糙度在1.0微米左右,组间无显著性差异,均为中度粗糙表面。材料的截面扫描电镜结果显示,随着合金中铜含量的增加,合金基体中Ti2Cu析出相也相应增多,Ti2Cu条带间的距离减小,排列更加紧密。接触角测定结果表明,四组材料合金接触角均大于90度,均为疏水表面。铜离子溶出试验中,Ti-3Cu,Ti-5Cu合金前3天的Cu2+释放量随着时间的延长显著增加;3天至28天过程中,Ti-3Cu的Cu2+释放匀速缓慢的增加而Ti-5Cu合金中的Cu2+离子释放量基本维持不变。Ti-7Cu表面释放的Cu2+离子含量较高且随着时间的延长逐渐增加,在28天后达到475.4mg/L,远远高于Ti-3Cu,Ti-5Cu表面的Cu2+离子含量。体外抗菌实验:平板菌落计数法检测Ti-x Cu（x=3,5,7 wt%）合金的抗菌活性发现:Ti-3Cu表面抗菌率为92.5%,具有杀菌活性;Ti-5Cu,Ti-7Cu表面的抗菌率分别为99.4%和99.9%,具有极强的杀菌活性。这说明Ti-5Cu与Ti-7Cu的抗菌率均大于Ti-3Cu,且两者的抗菌率相近。细菌生存力检测试剂盒检测结果表明Ti-5Cu和Ti-7Cu均具备阻止细菌生长和细菌生物膜形成的作用。三染色体系（DAPI+SYPRO+Con A）荧光染色发现对照组Ti表面形成一层连续的细菌生物膜,为更多的细菌繁殖提供了便利条件。相反地,Ti-3Cu表面零星分布着少量细菌,Ti-5Cu和Ti-7Cu表面基本无细菌存活,没有观察到胞外多糖和蛋白,也无菌斑生物膜形成。扫描电镜结果显示Ti表面黏附大量金黄色葡萄球菌,菌体呈球形,大量细菌聚集堆积成簇,呈葡萄串状排列。Ti-3Cu,Ti-5Cu和Ti-7Cu表面均出现黏附的破碎死亡的菌体,细菌出现明显塌陷、皱缩。透射电镜结果显示,金黄色葡萄球菌与Ti-3Cu共培养24小时后,细菌皱缩变形。Ti-5Cu和Ti-7Cu与金黄色葡萄球菌作用24小时后,细菌表面破裂,胞质大量流失,内部中空,细菌死亡。与材料共孵育24小时后的细菌扫描电镜结果也与前述抗菌实验结果相一致。综上所述,Ti-Cu合金均具有一定的抗菌性能,总体抗菌性能为Ti-7Cu≥Ti-5Cu>Ti-3Cu.体外细胞实验:四组材料与MC3T3-E1细胞共培养后结果表明,细胞增殖未受到影响,其中Ti-5Cu在第7天时细胞增殖最快。根据毒性评价标准分级,Ti-3Cu及Ti-5Cu的RGR%均为0级,Ti-7Cu为1级。细胞黏附实验结果表明,与纯Ti相比,Ti-Cu合金的表面形貌有利于MC3T3-E1细胞的黏附和伸展,细胞紧密连接,伸展情况良好。细胞凋亡实验中发现三种Ti-Cu合金材料均具有良好的生物相容性,符合植入材料的标准要求,其中Ti-5Cu组的细胞早期凋亡率最低。成骨性能相关因子检测发现,Ti-5Cu组和Ti-7Cu组在3天时能显著的增加细胞内碱性磷酸酶的水平。同时,Ti-5Cu组在7天时间点能上调成骨细胞成骨相关基因Runx2,OPN和Collgen I的m RNA表达水平。体内植入实验:动物体内植入实验表明,植入比格犬下颌骨三个月后,X射线观察、Micro-CT和亚甲基蓝-酸性品红染色结果都显示,Ti-5Cu种植体与Ti种植体骨结合能力相似,均具有良好的骨结合性能,种植体周围无明显的骨吸收现象。结论:1.Ti-x Cu（x=3,5,7 wt%）合金和Ti材料表面性能相似,平均表面粗糙度基本相同,均为中度粗糙表面。接触角均大于90度,均为疏水表面特性。2.随着合金中铜含量的增加,合金基体中Ti2Cu析出相也相应增多,Ti2Cu条带间的距离减小,排列更加紧密。3.三种材料的Cu2+释放速度中,Ti-7Cu释放最快最多,Ti-5Cu的Cu2+离子速度稳定,释放量适中,Ti-3Cu释放量最低。4.Ti-3Cu具有杀菌活性,Ti-5Cu和Ti-7Cu表面具有极强的杀菌活性,总体抗菌性能Ti-7Cu≥Ti-5Cu>Ti-3Cu。Ti-5Cu,Ti-7Cu能够很好地抑制细菌生物膜的形成。5.Ti-x Cu（x=3,5,7 wt%）合金对MC3T3-E1细胞增殖的影响小,其中Ti-5Cu最有力于细胞增殖。同时,发现三组Ti-Cu合金材料的RGR均高于75%,符合植入材料标准要求。根据毒性评价标准分级（CTG）,Ti-3Cu及Ti-5Cu为0级,Ti-7Cu为1级,Ti-3Cu和Ti-5Cu无细胞毒性。6.铜元素的加入有促进MC3T3-E1细胞成骨分化的作用,Ti-5Cu和Ti-7Cu显示出较好的促成骨能力。7.动物体内研究发现,Ti-5Cu种植体比Ti种植体抗菌性能好,能够有效的减少局部的牙龈红肿等症状。8.体内研究表明,Ti-5Cu种植体与Ti种植体的体内促成骨活性和骨结合性能较好。综合以上研究结果,Ti-5Cu合金有望成为新一代口腔金属植入体材料。