牛传染性鼻气管步(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus，IBRV)引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病，临床上主要以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征，还能引起母牛流产和死胎、肠炎和小牛脑炎，有时发生眼结膜炎和角膜炎。该病在世界范围内流行，并且每年都给养牛业造成巨大的经济损失，鉴于传统疫苗存在的弊端及该病毒的特点，近年来对活病毒载体疫苗的研究受到了更大的关注。本研究构建了一株牛传染性鼻气管炎病毒gC基因缺失的重组病毒，为构建表达外源基因的IBRV重组病毒及研制牛病活载体疫苗奠定了基础。同时截短表达了IBRV的gD糖蛋白，所表达的蛋白具有良好的反应性，可用于IBRV诊断试剂与亚单位疫苗的研究。本实验根据牛传染性鼻气管炎病毒全基因组序列(基因登陆号为NC 001847)设计引物，用PCR扩增gC基因上游和下游各1.4kb的片段作为同源重组臂，分别连入pMD18-T载体，并命名为pUgC和pDgC。限制性酶切和测序鉴定正确后，用XbaⅠ和NsiⅠ消化pUgC，将得到的的上游重组臂定向克隆于pdTK质粒，pdTK质粒中含有LacZ基因表达盒，可以通过蓝白斑筛选及酶切鉴定得到阳性克隆质粒，再用AsuⅡ和KpnⅠ消化此质粒，回收带有上游重组臂的大片段后与用AsuⅡ和KpnⅠ消化pDgC得到的下游重组臂连接得到pdgC~-／LacZ~+重组质粒转移载体。其中LacZ基因正好位于gC启动子的下游，LacZ基因编码氨基酸前面有25个由gC起始密码子ATG在内的75个核苷酸编码的氨基酸残基。采用磷酸钙-DNA沉淀法将经AsuⅡ线性化的pdgC~-／LacZ~+质粒转移载体和IBRV全基因组DNA共转染牛鼻甲细胞(BT)，待细胞病变达80％后收获病毒，按1：6倍比稀释病毒，接种MDBK细胞单层，用1％甲基纤维素限定细胞病变。待出现明显的病毒蚀斑后，用加有X-gal的1％低熔点琼脂糖覆盖后挑取病毒蓝斑，经6代篮色蚀斑筛选纯化及PCR鉴定得到稳定增殖的重组病毒rIBRV gC~-／LacZ~+。gD糖蛋白位于病毒囊膜及感染细胞的表面，其作为抗原产生的抗体中和病毒效果最好，成为研制亚单位疫苗的首选蛋白。本实验利用生物学软件DNAStar分析，以IBRV(Bartha Nu／67)基因组DNA为模板，PCR扩增出gD基因943bp的片段，然后将此目的片段定向克隆到pET30a表达载体中。经酶切和测序鉴定得到阳性重组质粒pET30a-tgD，然后将其转化BL21表达菌，经IPTG诱导得到部分可溶性表达的重组蛋白(tgD)。采用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下成功地纯化了重组蛋白(tgD)，纯化的重组蛋白浓度为0.852mg／ml，纯度为85.2％。Western blot和ELIsA检测证明纯化后的重组蛋白(tgD)可以被牛传染性鼻气管炎病毒抗血清所识别，具有良好的反应性，可以进一步开发研制牛传染性鼻气管炎诊断试剂及亚单位疫苗。