目的:生鲜牛乳中的体细胞是奶牛乳腺中的体细胞通过腺泡由血液渗入乳汁的。正常生鲜牛乳中的体细胞数(SCC)为20万个/ml~30万个/ml,其中白细胞占98%,国际上规定50万个/ml的体细胞数为乳腺炎的基准,超过该指标时,奶牛患乳腺炎的可能性随之增大。SCC作为原料奶的一项重要质量指标,一方面可以监控奶牛乳腺健康状况,另一方面,体细胞过高对牛乳成分和品质也会产生影响,牛乳体细胞检测是牛乳相关食品安全的技术保障。传统体细胞检测方法可分为直接和间接检测法两类:间接传统细胞检验技术是利用牛乳体细胞的物化特性进行测试,经济、简便但检测精度普遍较低;直接检测法中显微镜计数法是体细胞检测的金标准,但操作繁琐费时。基于单粒子探测原理的体细胞仪自动化程度高、快速准确,成为目前国内外研究的热点。但是由于生鲜牛乳作为一种多分散质乳浊液成分复杂,涉及样本前处理、探测光路和稳态液路等多个模块,因此基于单粒子探测原理的体细胞检测方法尚未完全发展成熟。综上,本课题首先开展生鲜牛乳样本荧光特性分析,然后对单粒子探测过程中涉及的光路和液路模块的优化方案进行讨论并试制样机,并完成样机的系统性能指标与计数准确性的评价测试,最终提出一套基于单粒子探测原理的体细胞检测标准流程,实现体细胞检测专用平台关键技术突破,为生鲜牛乳体细胞现场快速定量检测提供科学的解决方案。研究内容和研究方法:本文设计课题以生鲜牛乳中的体细胞作为探测目标,针对生鲜牛乳这一多分散质乳浊液,排除蛋白质、脂肪球以及其中可能存在的其它粒子荧光对体细胞的干扰,确定样本检测方案。在课题组现有单粒子探测技术研究的基础上,通过对体细胞单粒子探测系统中关键技术与模块单元实现方法的讨论,优化探测光路与稳态液路核心模块,并对体细胞检测系统平台进行工程化实现。对体细胞检测单粒子系统性能评价方法进行讨论并对相关指标进行测试,在各项指标均合格的条件下,完成计数准确性测试实验:以传统镜检法为对照,考察本系统是否可以实现对生鲜牛乳中体细胞的准确计数。具体研究方法和研究内容包括以下四个方面。1)生鲜牛乳荧光特性的分析和讨论:单粒子探测对所要分析的样品背景荧光有比较严格的要求,与目标物的荧光发射峰相近的自体荧光信号会影响检测结果。因此,课题通过检测生鲜牛乳的内源性荧光,借助荧光光谱对潜在的干扰物内源性荧光特性进行分析,找出影响体细胞单粒子探测的干扰波段。以自体荧光分析结果为生鲜牛乳中体细胞样本检测方案设计的理论基础,确定光源、染料和探测通道设置,以确保生鲜牛乳中体细胞的能被准确识别。2)体细胞单粒子探测系统中的光路模块关键技术研究:光路模块主要是整形光路与探测光路两部分。为获得厚度一定且能量密度呈高斯分布的线型光斑,需设计整形光路,然后基于ZEMAX光学仿真软件进行仿真,并根据仿真结果来指导光学平台的搭建,进行验证实验。体细胞单粒子探测通道的优化设计包括光收集和共焦降噪两部分,通过分析采集到的原始信号,优化探测通道参数设置,以提高探测通道收集效率和灵敏度。3)体细胞单粒子探测系统中的液路模块关键技术研究:针对单粒子探测系统中涉及的流动池和液体管路系统两部分进行优化设计。首先对鞘液流速参数进行探索性实验,确保流体在两级鞘液聚焦设计的流动池中以稳定的层流状态流动。然后设置不同的鞘液/样本液流速比,通过Fluent仿真观察其对聚焦后样本流直径的影响,分析聚焦效果最优的流速比值范围,并以稳定性最佳的液流流段作为激光检测段。管路系统优化则是对原管路模块存在的问题进行分析并改进,在每份样本检测结束时添加自动清洗机制,实现对流动池、管壁和进样针及时有效的双向清洗,减少牛乳样本液对管路的污染,降低系统携带污染率,确保检测结果的可靠性。4)体细胞单粒子探测系统性能评价方法研究与相关指标测试:体细胞单粒子探测系统的性能评价包括系统指标和计数准确性两部分。完成系统光路、液路优化后,将系统各模块联合装配,参考单粒子技术指标的一般要求,进行单粒子样机系统指标测试,主要包括分辨率、线性、灵敏度和携带污染率等指标,一方面对优化效果进行验证,另一方面,为牛乳样本的体细胞检测的可靠性提供支持与保证。在单粒子样机系统指标测试达标的情况下,以金标准显微镜计数和现有流式细胞仪为对照,进行不同浓度体细胞计数准确性对比实验。本课题通过以上四个方面开展研究工作,针对生鲜牛乳体细胞这一专项检查,提出标准检测流程,实现体细胞检测专用平台关键技术突破,为牛乳体细胞现场快速定量检测提供支撑。本文的创新点,一是在传统液力聚焦的基础上提出两级液力聚焦设计,提高了流体约束水平;二是形成了单激光单通道精简检测系统,在我国首次提出了一套基于单粒子探测原理的牛乳体细胞检测完整方法。结果:生鲜牛乳荧光特性实验结果:生鲜牛乳样本在300~420nm激发下,自体荧光发射峰在525nm左右。选取405nm激光器和DAPI核酸荧光染料,对生鲜牛乳样本进行染色检测,体细胞发射的荧光峰在460nm左右,与牛乳的自体荧光有较好的区分,单荧光通道即可实现体细胞的检测。体细胞单粒子探测系统光路优化实验结果:经柱镜组整形后的光斑在检测区的尺寸约为100μm×20μm,光斑能量密度呈高斯分布。仿真实验与光学平台实际获得光斑结果一致,调整两柱镜到检测区的距离,可实现离焦,获得一组厚度为5~30μm不同的高斯光斑。RCP-30-5A-2荧光微球在PMT增益700m V下电压响应信号数据显示,探测通道设置共焦模块后,较无共焦模块时信噪比提高了0.57倍;在共焦模块添加光阑后,较无光阑时信噪比又提高了0.72倍。可见探测通道添加共焦和光阑,对大增益下微弱信号的信噪比有较好的提升效果。体细胞单粒子探测系统两级鞘液聚焦优化实验结果:将样本流速率设置为较高的1μl/s,鞘液/样本液流速比在5~15倍范围内时,鞘液与样本液在两级鞘液聚焦下为层流,理想条件下聚焦效果较好的样本流直径理论值在10μm内。单级、两级液力聚焦结构的fluent仿真结果与理论计算趋势一致,在鞘液/样本液流速比相同的情况下,两级液力聚焦后的样本流直径均小于单级液力聚焦。检测段中间区域层流较稳定,适于激光检测。体细胞单粒子探测系统性能评价实验结果:用标准荧光微球测试,变异系数CV值随进样速率增大而增大,进样速率1μl/s以内,CV均小于2%。用8 peaks微球测试,荧光通道内粒子的平均荧光强度与其所携带的荧光分子总数之间的线性相关性R2=0.9921,CSB通道的荧光灵敏度为3.83 MESF。携带污染率3组重复试验结果,携带污染率C最大值为0.80%,平均值为0.76%。体细胞单粒子探测系统SCC计数准确性实验结果:离心样本SCC普遍低于不离心的样本,两组实验结果差异极其显著(P<0.01)。对不同浓度体细胞样本计数,单粒子样机与ife流式细胞仪、荧光显微镜测得SCC数据组间差异不显著(P>0.05)。单粒子样机的SCC计数结果是荧光显微镜SCC的91.92%以上,是life流式细胞仪SCC的98.64%以上。重复性实验结果的标准差分析显示,低体细胞浓度样本下,荧光显微镜的重复性高于流式细胞仪和单粒子样机,而高体细胞浓度样本下,荧光显微镜的重复性较低,单粒子样机的重复性最好。结论:课题的研究成果为生鲜牛乳中的体细胞现场快速便捷、准确定量检测提供了一系列可行方法,实现体细胞检测专用平台关键技术突破,提出了体细胞单粒子探测系统的性能评价方法,拓展了单粒子探测的应用领域,为基于单粒子探测原理的体细胞检测技术的推广应用提供了方法与实践的参考。