巨噬细胞胞外诱捕网（METs）是一种区别于细胞凋亡和细胞坏死的先天免疫防御机制,当巨噬细胞受到刺激物激活后,染色质发生解聚,随后核膜破裂,细胞膜解体,一种以DNA为主要骨架,由组蛋白和各种颗粒蛋白酶共同组成的网状结构被释放到细胞外,从而对病原物生物进行捕获和杀伤,在机体的固有免疫应答中发挥作用。在机体内,适量的METs的形成和释放有利于清除入侵的病原体,促进组织抗炎修复,而METs的过量产生会导致组织损伤和器官功能障碍。补体裂解产物C5a是补体系统激活过程中释放的一种免疫调节剂,参与多种生物过程,有研究表明补体C5a可招募和活化中性粒细胞,导致免疫受体Toll样受体（TLR）和补体受体的上调,外周血单核细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）预处理后使用补体成分C5a进行刺激时,能够使其释放NETs。近年来,许多研究者不断对METs形成过程中涉及的效应机制进行探索和验证,但是关于METs形成的具体分子机制仍不清楚。因此,系统地筛选METs形成过程中的关键效应基因,对于解析METs形成的分子机制具有重要意义。本研究利用鼠CRISPR/Cas9全基因组敲除文库,系统地对C5a蛋白刺激J774A.1小鼠单核巨噬细胞形成METs的相关基因进行筛选,并从中初步鉴定出能够显著抑制METs形成的基因,主要研究结果如下:1.确定C5a刺激J774A.1细胞形成METs的条件首先进行原核表达并纯化mouse C5a蛋白,分别使用（5、10、20、40）μg/m L的C5a蛋白刺激J774A.1细胞,于刺激0h,2h,4h及6h时观察细胞胞外DNA形成情况,结果发现,在刺激2h时,各组细胞均能释放胞外DNA,并在刺激4h时效果最显著。为了进一步确认C5a刺激J774A.1细胞所释放的胞外DNA是否为巨噬细胞胞外诱捕网,本研究通过间接免疫荧光实验对METs形成的标志物H2A-H2B-DNA复合物进行检测,结果显示,使用20μg/m L C5a刺激J774A.1细胞4h时,所产生的胞外网状物质为METs。2.筛选影响METs形成的关键基因为了利用全基因组敲除文库对METs形成过程中的关键调控基因进行系统地鉴定,本研究首先利用慢病毒包装系统将鼠Ge CKOv2文库质粒包装成慢病毒,并使用文库慢病毒感染J774A.1-Cas9细胞,构建鼠全基因组敲除文库,经测序显示文库覆盖率可达95%左右。随后使用C5a刺激全基因组敲除文库细胞和对照组细胞,至对照组细胞全部死亡,将存活的文库细胞扩大进行C5a二轮刺激,收取最终存活的文库细胞,提取细胞基因组并扩增sg RNA片段进行二代测序。对测序结果进行MAGec K分析,共计富集236个存在显著差异的基因（P＜0.01）,并根据GO和KEGG分析发现,被富集的信号通路有神经营养因子信号通路、调节干细胞多能性的信号通路、长时程增强作用等。3.发现Baaz2b和Gm13084参与METs的形成过程本研究在所富集的前50名基因中,将富集的sg RNA大于等于2条,以及文库富集倍数为10倍以上的基因作为候选基因,从中确定了13个可能会影响METs形成的候选基因,分别对其进行敲除细胞系构建,使用C5a蛋白进行刺激,检测各组细胞的METs形成情况。结果显示,在C5a刺激4h和6h时,BAZ2B,Gm13084,Cpa2和Tdgf1敲除细胞组均能够显著降低METs的释放（P＜0.05）,其中BAZ2B和Gm13084敲除细胞系与对照组相比存在极显著的差异（P＜0.01）。此外,Ate1,SLC35F2和mir-297a-4组显著增强了METs的释放（P＜0.01）。为了确定BAZ2B和Gm13084在METs形成过程中发挥的作用,我们分别对其敲除细胞进行了单克隆纯化,并使用慢病毒系统对BAZ2B和Gm13084敲除细胞进行基因回补,发现进行回补之后能够恢复其METs形成的细胞表型,初步验证了BAZ2B和Gm13084敲除能够有效抑制METs的释放。综上所述,本研究通过鼠全基因组敲除文库筛选到的BAZ2B和Gm13084基因能够显著抑制C5a刺激的METs形成,提示BAZ2B和Gm13084基因可能在METs形成过程中发挥重要的调控作用。