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中风是世界范围内造成患者长期严重残疾和死亡的最常见疾病之一。大约80-85%的中风病例是由脑缺血引起的,脑缺血通常是由大脑主动脉栓塞或血栓栓塞所致。干预需要恢复血流,但容易导致再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤是一种在血液灌流短期恢复后,缺血缺氧引起的神经损伤进一步加重的病理过程。越来越多的证据表明,脑缺血通常涉及一系列神经事件,如缺氧、氧化应激和炎症反应,最终导致缺血脑细胞的急性坏死、凋亡和自噬。组织型纤溶酶原激活剂（Tissue plasminogen activator,tPA）是目前治疗脑缺血再灌注损伤唯一有效方法。因此,寻找新的、有效的治疗靶点,揭示脑缺血的分子机制是非常必要和迫切的。肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）相关和异质性胞核核糖核蛋白（Heterogeneous nuclear ribonucleoproteinL,HNRNPL）相关免疫调节长链非编码 RNA（TNF and HNRNPL related immunoregulatory long non-coding RNA,LncRNATHRIL）是一种新发现的 lncRNA,是调节 TNF-α 表达的关键参与者。在本课题中,我们首次研究了 THRIL在脑缺血再灌注损伤中的作用。在此实验中我们通过构建大脑中动脉闭塞/再灌注（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）大鼠模型和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的缺氧缺糖再复氧（Oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R）细胞模型,以评价THRIL在脑缺血再灌注损伤中的表达,作用和分子机制。第一部分LncRNATHRIL在脑缺血再灌注损伤体外和体内模型中表达上调目的:检测MCAO/R大鼠模型和OGD/R SH-SY5Y细胞模型中的lncRNA THRIL表达水平。方法:1.构建脑缺血再灌注MCAO/R大鼠模型,将大鼠分组为两组,即Sham组和MCAO/R组。2.构建人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的缺氧缺糖再复氧（OGD/R）细胞模型,将细胞分组为Control组和OGD/R组。3.对大鼠模型进行神经功能障碍评分（Bederson and Longa score system）。4.对大鼠模型脑梗死体积的脑区进行TTC（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride）染色及定量分析。5.QRT-PCR 和荧光免疫染色法检测脑缺血再灌注损伤体内和体外模型中的lncRNATHRIL的表达水平。结果:1.MCAO/R组大鼠神经功能缺损评分显著高于Sham组大鼠。2.MCAO/R组大鼠的脑梗死体积显著大于Sham组大鼠（P＜0.01）。3.在MCAO/R组大鼠组织中,lncRNA THRIL 的表达水平亦大于 Sham 组（P＜0.01）。4.在 OGD/R 组 SH-SY5Y 细胞中,lncRNATHRIL的表达水平显著大于Control组（P＜0.01）。结论:LncRNATHRIL表达水平在MCAO/R大鼠模型和OGD/R细胞模型中均上调。第二部分敲减lncRNATHRIL减轻脑缺血再灌注损伤体外模型中细胞的凋亡目的:检测敲减lncRNATHRIL的表达对OGD/R SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法:1.设计能够敲减THRIL的shTHRIL,在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的OGD/R模型中转染,实验分组为Control,shNC,shTHRIL#1和shTHRIL#2组。2.QRT-PCR法检测敲减效率,挑选敲减效率最高的敲减序列进行后续实验,将OGD/R SH-SY5Y 细胞模型分组为 Control,OGD/R,OGD/R+shNC 和 OGD/R+shTHRIL 组。3.MTT实验检测细胞增殖能力。4.TUNEL实验检测细胞凋亡。5.蛋白质印迹法（Western blot,WB）检测细胞中凋亡相关蛋白,包括Cleaved caspase-3,Bcl-2和Bax的表达变化。结果:1.shTHRIL转染后细胞中THRIL的表达显著下调,shTHRIL#2敲减效率更高（P＜0.01）。2.THRIL的下调显著增加了 OGD/R SH-SY5Y细胞增殖（P＜0.01）。3.THRIL的下调明显抑制了 OGD/R SH-SY5Y细胞的凋亡（P＜0.01）。4.THRIL的下调显著抑制了凋亡蛋白即Cleaved caspase-3和Bax的表达,而明显增加了 Bcl-2的表达（P＜0.01）。结论:THRIL的下调可以促进SH-SY5Y细胞的增殖,抑制了细胞的凋亡。第三部分敲减lncRNATHRIL降低脑缺血再灌注损伤体外模型中细胞的炎症反应目的:检测敲减lncRNA THRIL的表达对OGD/R SH-SY5Y细胞炎症反应的影响。方法:1.人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的OGD/R模型中转染shTHRIL质粒,实验分组为Control,OGD/R,OGD/R+shNC和OGD/R+shTHRIL组。2.QRT-PCR和ELISA检测SH-SY5Y各分组细胞中炎症相关因子IL-6,IL-1β和TNF-α的表达水平。结果:敲减THRIL的表达显著下调OGD/R SH-SY5Y细胞中炎症相关因子IL-6,IL-1β和TNF-α的表达水平。结论:THRIL的下调可抑制OGD/R诱导的炎症反应。第四部分THRIL通过抑制miR-24-3p上调NRP1经NF-κB p65信号通路调节神经元细胞凋亡和炎症反应目的:探讨lncRNATHRIL对脑缺血再灌注损伤引起的神经元细胞凋亡和炎症反应影响的分子机制。方法:1.RNA22网站预测lncRNA THRIL靶向结合miR-24-3p。2.在人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y 中共转染 pmirGLO-THRIL-wt+NC mimic,pmirGLO-THRIL-wt+ miR-24-3p-mimic,pmirGLO-THRIL-mut+NC mimic,pmirGLO-THRIL-mut+miR-24-3p-mimic,进行双荧光素酶报告实验。3.构建空载质粒pcDNA3.1和THRIL过表达质粒pcDNA3.1-THRIL,转染进SH-SY5Y细胞OGD/R模型中,实验分组为si-NC,si-THRIL,pcDNA3.1-NC种 pcDNA3.1-THRIL 组,qRT-PCR检测 THRIL 和miR-24-3p表达水平。4.QRT-PCR检测MCAO/R大鼠模型和SH-SY5Y细胞OGD/R模型中miR-24-3p的表达水平。5.多个网站预测miR-24-3p靶向结合NRP1。6.通过双荧光素酶报告实验验证miR-24-3p靶基因NRP1。7.在OGD/R SH-SY5Y细胞中转染 NC-mimic/miR-24-3p-mimic 和/或 pcDNA3.1/pcDNA3.1-THRIL,实验分组为NC-mimic+pcDNA3.1-NC,miR-24-3p-mimic+pcDNA3.1-NC,miR-24-3p-mimic+pcDNA3.1-THRIL,NC-mimic+pcDNA3.1-THRIL,WB 法检测转染后 OGD/R SH-SY5Y细胞中NRP1蛋白的表达量。8.WB法检测MCAO/R大鼠和OGD/R SH-SY5Y细胞中NRP1蛋白的表达量。9.根据不同处理将人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 分为 Control 组,OGD/R 组,OGD/R+pcDNA3.1-NC 组,OGD/R+pcDNA3.1-THRIL组,OGD/R+NC-mimic 和 OGD/R+pcDNA3.1-THRIL+miR-24-3p-mimic组。10.MTT实验检测细胞活力。11.TUNEL实验检测细胞凋亡。12.WB法检测细胞中凋亡相关蛋白的表达水平,包括Cleaved caspase-3,Bcl-2和Bax。13.QRT-PCR和ELISA检测SH-SY5Y各分组细胞中炎症相关因子IL-6,IL-1β和TNF-α的表达水平。14.WB法检测细胞中NF-κB p65信号通路相关因子P65和p-P65的表达。结果:1.THRIL靶向结合miR-24-3p。2.THRIL过表达时,OGD/R SH-SY5Y细胞中miR-24-3p表达水平下调,相反,敲减THRIL时,细胞中miR-24-3p表达水平则上调。3.MCAO/R大鼠模型和OGD/R SH-SY5Y细胞模型中,miR-24-3p的表达水平均下降。4.miR-24-3p靶向结合NRP1。5.NRP1的蛋白表达量:NC-mimic+pcDNA3.1-THRIL＞miR-24-3p-mimic + pcDNA3.1-THRIL≈NC-mimic+pcDNA3.1-NC＞miR-24-3p-mimic+pcDNA3.1-NC,证明了在 OGD/R SH-SY5Y 细胞中上调miR-24-3p抑制了 NRP1的表达,而上调THRIL可以促进NRP1的表达。6.在MCAO/R大鼠模型和OGD/R SH-SY5Y细胞模型中,NRP1的表达上调。7.过表达THRIL会引起OGD/R SH-SY5Y细胞活性降低,同时过表达miR-24-3p,则会明显恢复细胞活性。8.过表达THRIL会增加OGD/R SH-SY5Y细胞凋亡,同时过表达miR-24-3p,则会显著降低细胞凋亡。9.过表达THRIL会增加OGD/R SH-SY5Y细胞炎症反应,同时过表达miR-24-3p,则会显著降低细胞炎症反应。10.过表达THRIL会增加OGD/R SH-SY5Y细胞中NF-κB p65信号通路相关蛋白p-P65的表达,同时过表达miR-24-3p,则会显著降低p-P65的表达的表达量。结论:THRIL通过抑制miR-24-3p上调NRP1经NF-κB p65信号通路调节神经元细胞凋亡和炎症反应。第五部分THRIL的沉默可改善大鼠脑缺血再灌注模型的神经功能目的:探讨THRIL的沉默对MCAO/R大鼠模型神经功能的影响。方法:1.根据不同处理将大鼠分组为sham,MCAO/R,MCAO/R+sh control和MCAO/R+sh THRIL组。2.对大鼠模型进行神经功能障碍评分。3.对大鼠模型脑梗死体积的脑区进行TTC染色及定量分析。4.WB法对4组大鼠脑组织中凋亡相关因子 Cleaved Caspase-3,Bcl-2 和 Bax 及 NF-κB p65 信号通路中的相关因子 p-P65/P65的表达量进行了检测。结果:1.敲减THRIL的表达显著降低大鼠神经功能损伤。2.敲减THRIL的表达显著降低大鼠模型的脑梗死体积。3.敲减THRIL的表达可以显著抑制Cleaved Caspase-3,Bax 和 p-P65/P65 的表达,促进 Bcl-2 的表达。结论:THRIL的沉默可改善MCAO/R大鼠模型的神经损伤,降低脑缺血再灌注损伤诱发的凋亡蛋白表达的升高,抑制NF-κB p65信号通路的激活。