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背景:血管内皮细胞(Endothelial cells,ECs)在调节血管功能和血管稳态上起关键作用,动脉粥样硬化、血管内膜损伤导致血管损伤性疾病,其共同病理生理基础是血管内膜损伤后引起内皮细胞功能失调,血管内皮细胞功能修复成为血管损伤性疾病主要的治疗方向。目前对于损伤血管内皮功能的恢复研究主要集中在基因治疗和干细胞治疗上。通过向血管壁不同成分上转染基因调节内皮功能可以改善常见的心血管疾病。但是受载体缺陷、只能部分修复部分内皮细胞,而基因治疗尚不能达到完全恢复或替代正常内皮细胞的生理功能。干细胞移植治疗近年来已成为治疗多种疾病的新策略,其目的是替代、修复或加强受损组织或器官的生物学功能。干细胞具有在体外培养保持未分化状态的增殖能力及分化为各种中胚层来源细胞类型的潜能,正成为生物学、医学中最具有吸引力的研究领域之一。研究发现骨髓及外周血中存在干细胞来源的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),在体外经诱导分化可表达内皮细胞特征性抗原,在体内局部微环境作用下能发育为适宜局部生长的内皮细胞,具有修复、恢复受损内皮细胞功能的潜能。烧伤、血管外科手术等引起了血管内皮损伤,导致细胞因子如VEGF、FGF等的释放,刺激骨髓中内皮祖细胞大量动员入外周血,可能参与血管内皮再生有关。干细胞向内皮细胞分化需要局部微环境诱导,其中尤为重要的细胞因子是VEGF。因此,受这些新观念及实验研究的启发,结合基因和干细胞治疗优势,将诱导EPCs向内皮细胞分化的重要细胞因子VEGF基因转染至体外培养的EPCs,从而提高EPCs向受损血管归巢、并强化其向内皮细胞分化能力,进一步提高EPCs对内皮细胞损伤性血管性疾病的治疗效果。EPCs易于从骨髓中获取,与胚胎干细胞和骨骼肌干细胞相比具有更大的优势,取材机体创伤小,体外培养过程中保持未分化表型不断增殖达到所需数量,经诱导后可分化为内皮细胞。借鉴这些研究基础,本研究采用体外分离培养实验大鼠骨髓源性内皮祖细胞。将构建的携带人VEGF 165基因的pcDNA3质粒转染至EPCs,观察基因修饰对EPCs的粘附、迁移、增殖及向内皮细胞分化的影响。复制实验大鼠股动脉内膜损伤模型,将转染人VEGF 165基因的EPCs移植入大鼠体内,观察基因修饰EPCs归巢至损伤内膜及损伤血管段内皮结构变化,评价损伤血管段局部再内皮化过程中基因修饰对EPCs的功能影响。将基因治疗和干细胞治疗方法联合应用在血管损伤的内皮修复治疗,探讨基因修饰EPCs对损伤血管的再内皮化、重建血管生物学功能、治疗内膜损伤性血管性疾病的作用。方法:1.构建携带人VEGF165基因的真核表达质粒:扩增、提取质粒pGEM-hVEGF165中hVEGF165目的基因,插入pcDNA3质粒载体,构建含有hVEGF165基因的真核表达质粒载体,酶切、测序鉴定。2.EPCs的分离纯化、培养、鉴定:采用密度梯度离心法从大鼠骨髓分离EPCs,原代培养后,透射电镜观察内皮祖细胞内部超微结构,荧光倒置显微镜鉴定DiI-AcLDL与FITC-UEA-I染色双阳性细胞为正在分化的EPCs。3.对EPCs进行VEGF基因转染、扩增,改良Boyden小室分析基因修饰EPCs的粘附、迁移能力,ELISA方法分析EPCs中VEGF水平、MTT法分析细胞的增殖活性。4.复制血管内膜损伤动物模型,将基因修饰EPCs移植到实验大鼠体内,观察转基因EPCs归巢、向内皮细胞分化情况,分析基因修饰EPCs对损伤血管段局部再内皮化的影响。结果:1.重组质粒通过酶切和测序鉴定证实了hVEGF165定向插入到真核表达载体中。pcDNA3-hVEGF165可用于真核细胞的转染。2.EPCs的分离纯化、培养、鉴定:密度梯度离心法分离的实验大鼠骨髓单个核细胞。培养3天后,镜下可见有细胞贴壁,培养至7天贴壁细胞逐渐增多,并呈现铺路石样。用DiI-acLDL及FITC-UEA-I对细胞染色后,通过荧光显微镜观察显示呈黄色的染色双阳性细胞,vWF免疫组化染色呈棕黄色的阳性细胞,证实为正在分化的EPCs。3.ELISA方法检测基因修饰EPCs各时相点均有VEGF表达。基因修饰EPCs的迁移和粘附能力增强。转染组与空质粒组、对照组间的比较差异显著(P＜0.01)。MTT法检测基因修饰EPCs增殖活性增强,转染组与空质粒组、对照组间的比较差异显著(P＜0.05)。4.通过弹性导丝损伤的方法,在实验大鼠股动脉建立血管内膜损伤模型。基因修饰EPCs移植到实验大鼠体内,可以粘附、存活在血管内膜损伤部位,损伤修复较正常EPCs组好。结论:1.本实验构建的真核表达载体pcDNA3-hVEGF165含有人VEGF165基因序列,可用于VEGF165基因的真核表达及调控的研究。2.基因修饰EPCs有VEGF高表达。3.基因修饰增强EPCs的粘附、迁移和增殖功能。4.移植到体内的EPCs可以在归巢至损伤血管内膜并存活。基因转染的EPCs移植较单纯EPCs移植,其促内膜修复的能力更强,相同数量的细胞移植,基因转染的EPCs具有更强的修复损伤血管内膜能力,能更好的恢复正常的血管内皮结构。