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山羊痘病毒属包括绵羊痘病毒(SPPV),山羊痘病毒(GTPV)和结节性皮肤病毒(LSDV。牛是LSDV常见感染宿主,并且在大多数非洲国家和中东都存在。然而,“SPPV”与“绵羊痘病毒”和“GTPV”与“山羊痘病毒”通常感染绵羊和山羊,主要发生在非洲,中东和亚洲。而且由“SPPV”与“绵羊痘病毒”感染引起的发病率和死亡率高达100%。有效的诊断,是防治该病的重要前提。但目前尚无针对“SPPV”与“绵羊痘病毒”的商业化和专门的诊断技术。包膜蛋白P32是“SPPV”与“绵羊痘病毒”的主要结构蛋白,其在“SPPV”与“绵羊痘病毒”的致病过程中发挥重要作用,并且参与诱导宿主体液和细胞免疫的产生。值得一提的是,来源于山羊痘病毒属的P32蛋白具有种属特异性B细胞表位,因此,P32蛋白具有作为开发“SPPV”与“绵羊痘病毒”检测特异性诊断的有效靶标的巨大潜力。本研究将“SPPV”与“绵羊痘病毒”的p32基因分别克隆到pGEX-6p-1和pcDNA3.1载体进行原核及真核表达,将纯化获得的P32重组蛋白免疫接种BALB/c小鼠制备抗P32的多克隆抗体;同时建立了基于多肽表位的检测抗P32抗体的ELISA方法,并利用建立的基于多肽ELISA技术筛选获得2株抗P32蛋白的特异性单克隆抗体。这些绵羊痘病毒P32蛋白表达载体构建,P32蛋白表达,基于多肽ELISA建立以及抗P32单克隆抗体的研制为进一步开发绵羊痘病毒的诊断及有效免疫防控技术提供了材料,打下了基础。1.绵羊痘病毒p32基因的克隆与表达为了构建p32的原核和真核载体,将合成的p32基因克隆到载体pGEX-6p-1和pcDNA3.1中,重组质粒命名为pGEX-6p-1-P32和pcDNA3.1-P32。重组pGEX-6p-1-P32转化入Rosetta感受态细胞,并经IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组GST-P32融合蛋白表达成功,且大部分以可溶性形式表达。GST-P32融合蛋白经GST琼脂糖凝胶柱纯化后免疫BALB/c小鼠获得抗P32的多克隆抗体。Western blot与间接免疫荧光试验证明所制备的抗P32的多克隆抗体不仅能与GST-P32融合蛋白进行反应,而且可有效识别转染真核质粒pcDNA3.1-P32细胞中表达的P32蛋白。这些结果表明表达的P32蛋白具有良好的免疫原性。以上构建的于P32的表达载体和所制备的针对P32蛋白的多克隆抗体为进一步研制抗P32的单克隆抗体提供了材料。2.绵羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体的研制为了筛选针对P32的特异性单克隆单抗,首先建立了基于P32多肽的ELISA方法。首先利用DNAStar软件,根据SPPV的P32蛋白序列设计和合成了六个多肽(分别命名为P32-P1,P32-P2,P32-P3,P32-P4,P32-P5和P32-P6)。对抗P32的小鼠多克隆抗体的检测结果发现,基于多肽P32-P1和P32-P4的ELISA检测效果最佳。因此,在筛选抗P32单克隆抗体的ELISA检测中,以多肽P32-P1和P32-P4作为包被原。通过将骨髓瘤细胞SP2/0与经GST-P32融合蛋白免疫的小鼠的脾细胞融合,多肽ELISA筛选以及亚克隆,研制出两株抗P32蛋白的特异性单克隆抗体,分别命名为1D5和3A6。单抗1D5和3A6不仅具有ELISA反应,而且还能通过间接免疫荧光识别DF1细胞中表达的P32蛋白。以上基于多肽的检测P32抗体的ELISA方法的建立以及抗P32蛋白的单克隆抗体研制为SPPV的有效诊断及其试剂盒的开发奠定了基础。