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研究背景和目的:重症中暑(Heatstroke)是危及人类生命的热相关性疾病,常合并多脏器功能不全。肺损伤是早期高发的并发症之一,主要表现为肺水肿、肺出血及呼吸衰竭。热打击可引起肺微血管内皮细胞(PMVECs)凋亡及程序性坏死,其是介导肺损伤的重要机制。蛋白酶激活受体1(Protease-activated receptor1,PAR1)是一种G蛋白偶联跨膜受体,是凝血酶激活进而导致炎症反应的主要受体。有研究显示,热打击后内皮细胞PAR1显著增加,引起血管内皮细胞通透性升高,从而导致小鼠肺损伤的发生,但其具体机制尚不明确。本研究选用C57BL/6小鼠及PMVECs,研究PAR1与下游信号NF-κB/c-Jun在热打击介导细胞凋亡中的作用及PAR1与下游RIP1/RIP3及MLKL/HMGB1在程序性坏死中的作用。主要方法和结果:1.建立重症中暑小鼠模型,成年雄性C57BL/6小鼠置于39℃、65%湿度的高温仓内,核心体温(Tc)达到42.7℃造模成功,分室温正常对照组(NC);重症中暑组(HS);PAR1抗体预处理中暑组(anti-PAR1);PAR1抑制剂RWJ56110预处理重症中暑组(RWJ+HS)。与HS组比较,使用RWJ56110及PAR1抗体腹腔注射预处理小鼠可明显改善小鼠热耐受力。给予PAR1抑制剂RWJ56110预处理可明显延长重症中暑小鼠生存时间,改善生存率;可降低重症中暑小鼠血清中TNF-α、IL-6及HMGB1水平,减轻全身炎症反应,同时可降低肺泡灌洗液中白细胞计数、中性粒细胞计数、蛋白含量、肺水及干湿重比,从而改善肺损伤。2.PMVECs给予43℃热打击90 min(中度热打击),在恢复温度各时间点(0,2,6,12 h),Hoechst33342染色后,用荧光显微镜观察细胞凋亡情况、Western blotting 检测 Mcl-1、Bax、PAR1 及 c-Jun 表达水平,ELISA 检测 Caspase-3及NF-κB活性,流式细胞仪分析细胞凋亡。结果示随复温时间延长,PMVECs细胞凋亡数目明显增加,Mcl-1、Bax、c-Jun、p-c-Jun表达水平、Caspase-3活性明显增加。给予PAR1 siRNA敲除PAR1及腺病毒过表达PAR1(Ad-PAR1)预处理细胞后,给予相同条件热打击,复温12 h检测相关蛋白表达及细胞凋亡情况,经Ad-PAR1及PAR1激动剂TFLLR-NH2预处理的细胞,Mcl-1明显降低、Bax的表达及Caspase-3活性显著增加,凋亡数目增加;PAR1 siRNA及PAR1抑制剂SCH79797预处理的细胞,Mcl-1明显增加、Bax的表达及Caspase-3活性显著下降,凋亡数目减少,同时还可使NF-κB DNA结合力增强,p-c-Jun和c-Jun的蛋白表达水平显著下降;使用c-Jun siRNA转染细胞,于热打击后复温12 h检测细胞凋亡情况,敲除c-Jun后,细胞凋亡显著减少,c-Jun活化在热打击的PMVECs起着促凋亡作用,我们前期研究结果表明NF-κB活化在热打击的PMVECs中起抗凋亡作用,综上所述,PAR1通过抑制NF-κB活化及增强c-Jun活化起着促凋亡作用。3.建立重症中暑小鼠模型,复温2 h,ELISA方法检测肺泡灌洗液中HMGB1及RIP3水平。与对照组比较,给予PAR1抑制剂RWJ56110处理的小鼠,肺泡灌洗液中HMGB1及RIP3水平降低;肺组织中RIP1/RIP3复合物的形成减少。PMVECs给予43℃热打击3 h(重度热打击),恢复期各个时间点(0,2,6,12 h)检测到RIP1及MLKL蛋白表达水平显著升高;恢复期6 h,坏死小体(RIP1/RIP3 复合物)形成;RIP1 抑制剂 Nec-1、RIP1siRNA、RIP3siRNA 及两者联合预处理可抑制PMVECs发生程序性坏死;给予PAR1抑制剂预处理,减轻热打击导致的HMGB1移位,减少细胞程序性坏死。结论PAR1可能通过抑制NF-κB活化及激活c-Jun促进热打击PMVECs凋亡,并通过促进RIP1/RIP3复合物形成导致PMVECs程序性坏死,从而引起重症中暑急性肺损伤。