论文部分内容阅读
2n配子在柑橘中普遍存在，是柑橘多倍体产生的重要途径。2n配子有多种形成机制，其遗传效应有明显差异，在柑橘多倍体育种中具有不同的应用价值。着丝粒定位有助于开发近着丝粒分子标记用于分析2n配子遗传结构，有效指导2n配子参与的多倍体育种策略，提高育种效率。受限于柑橘2n配子发生频率低、大规模2n配子有性群体创制难和着丝粒重复序列变异快等问题，柑橘着丝粒定位和序列特征研究进展缓慢。课题组前期以‘Nadorcott’橘橙(也称‘默科特橘橙’)为母本与6个四倍体父本倍性杂交创制了54株2n配子有性后代(四倍体)，是用于着丝粒定位的理想材料。基于此，本研究利用半四分体法定位柑橘着丝粒物理位置，同时利用染色质免疫共沉淀法获得与柑橘着丝粒组蛋白CenH3结合的着丝粒序列。主要研究结果如下：
1、利用‘Nadorcott’橘橙2n雌配子有性群体和半四分体(HTA)法定位柑橘着丝粒的物理位置。从‘Nadorcott’橘橙和6个四倍体父本(NH、NS、SD、SM、SP和4XPK)基因组重测序中筛选出母本杂合且父本纯合的124,563个多态性SNP标记，从中进一步筛选获得212个SNP标记用于分析54株2n雌配子四倍体后代的遗传组成。基于所有2n雌配子基因型，对2n配子在每个位点传递的杂合性分析表明，所有2n雌配子在143个(占所有分析位点的67.45%)位点传递的杂合性低于50%，卡方检验显示其中120个位点传递的杂合性显著低于50%(P<0.05)，表明第二次减数分裂核复原(SDR)是‘Nadorcott’橘橙2n雌配子形成的机制。根据SNP标记在染色体的位置和所有2n配子在每个SNP位点传递的杂合性构建‘标记-着丝粒’物理图谱；SDR机制下，杂合率接近或达到0的区域被认为是着丝粒候选区域，除4号染色体(Chr4)未定位到着丝粒候选区域外，其余8条染色体着丝粒候选区域大小介于1.12-18.19Mb之间。
2、利用柑橘着丝粒组蛋白CenH3和染色质免疫共沉淀(ChIP)法定位柑橘着丝粒的物理位置。利用cDNA末端快速扩增技术克隆柑橘着丝粒CenH3(CsCenH3)基因，CDS长度为450bp，编码149个氨基酸，位于甜橙基因组5号染色体。以CsCenH3蛋白N-RQRRSEAGEGTPTAQRKR多肽制备柑橘特异anti-CsCenH3多克隆抗体，利用ChIP技术获得与CsCenH3结合的着丝粒DNA并测序。将ChIP-seq和Input-seq(不经免疫沉淀的DNA)样本的有效读长比对到参考基因组，比对率为87.16%和72.57%；进一步数据分析表明，每条染色体上CsCenH3富集区段至少有1个，且ChrUn有许多高度富集区段，表明有较多着丝粒序列并未完整组装于甜橙基因组；根据每条染色体CsCenH3富集区段排名前10的物理位置，将其分为2个或3个区域，估算每条染色体的着丝粒区域介于0.01-7.60Mb之间。‘Nadorcott’橘橙基因组重复序列分析表明272个聚类群共占基因组大小的49.20%，长末端重复序列逆转录转座子是其重要组成，其中gypsy、copia和caulimovirus类型分别占基因组大小的25.89%、15.69%和5.90%；进一步分析高度富集CenH3蛋白的6个着丝粒候选聚类群，表明长末端重复序列逆转录转座子也是其着丝粒重复序列的主要类型。
3、HTA法和ChIP法结合能有效定位柑橘着丝粒区域。在HTA法定位的着丝粒候选区域共获得完全匹配的串联重复序列676个，从中筛选重复单体大于10且重复序列总长度大于5kb的10条串联重复序列作为着丝粒候选探针序列；与CsCenH3高度结合(ChIP/Input大于10)的6个聚类群(CL34、CL246、CL14、CL108、CL149和CL205)共包含700个重叠群，其中富集度最高或重复序列总长度最长的18条重叠群被选作着丝粒候选探针序列；以上28条着丝粒候选探针序列重复单体长度介于209bp到5433bp之间，重复次数介于3.7到85.6次之间，总长度介于5.85kb到95.10kb之间。染色体原位杂交实验表明，以2条完全匹配的串联重复序列和7条与CsCenH3高度结合的着丝粒候选序列作为探针，在大部分染色体着丝粒处有杂交信号，表明两种方法结合能有效定位柑橘着丝粒区域。
4、利用新开发的亲本多态性SNP标记鉴定四倍体后代遗传来源和沃柑2n配子形成机制。以前人创制的36株四倍体后代(以沃柑为母本，3个异源四倍体(PCS、PO和SP)为父本倍性杂交)为研究材料，从亲本基因组测序筛选父母本均纯合的11,004个多态性SNP标记中，进一步筛选出亲本多态性标记9个，用于36株四倍体后代遗传鉴定；所有四倍体后代都聚在亲本基因型中间，表明它们均为杂种来源，是沃柑2n雌配子与父本二倍体花粉受精的产物。从亲本测序中筛选母本杂合且父本纯合的亲本多态性SNP标记80,079个，其中20,591个标记位于上述两种方法定位的柑橘着丝粒区域；进一步筛选出亲本多态性近着丝粒SNP标记8个和远离着丝粒SNP标记9个，用于沃柑2n雌配子形成机制鉴定；所有2n配子在17个SNP位点传递的杂合性介于5.88%-11.6%之间，表明在个体水平上，第二次减数分裂核复原可能是沃柑2n雌配子形成的机制；36个2n雌配子在8个近着丝粒SNP位点传递的杂合性都是0，且在9个远离着丝粒SNP位点传递的杂合性介于0-86.11%，表明在群体水平上，第二次减数分裂核复原可能是沃柑2n雌配子形成的机制。
综上所述，本研究利用半四分体和染色质免疫共沉淀法定位柑橘着丝粒物理位置；分析柑橘着丝粒重复序列特征，并发掘了9条着丝粒特异的染色体原位杂交探针序列；开发了近着丝粒SNP标记并用于柑橘2n雌配子形成机制鉴定。
1、利用‘Nadorcott’橘橙2n雌配子有性群体和半四分体(HTA)法定位柑橘着丝粒的物理位置。从‘Nadorcott’橘橙和6个四倍体父本(NH、NS、SD、SM、SP和4XPK)基因组重测序中筛选出母本杂合且父本纯合的124,563个多态性SNP标记，从中进一步筛选获得212个SNP标记用于分析54株2n雌配子四倍体后代的遗传组成。基于所有2n雌配子基因型，对2n配子在每个位点传递的杂合性分析表明，所有2n雌配子在143个(占所有分析位点的67.45%)位点传递的杂合性低于50%，卡方检验显示其中120个位点传递的杂合性显著低于50%(P<0.05)，表明第二次减数分裂核复原(SDR)是‘Nadorcott’橘橙2n雌配子形成的机制。根据SNP标记在染色体的位置和所有2n配子在每个SNP位点传递的杂合性构建‘标记-着丝粒’物理图谱；SDR机制下，杂合率接近或达到0的区域被认为是着丝粒候选区域，除4号染色体(Chr4)未定位到着丝粒候选区域外，其余8条染色体着丝粒候选区域大小介于1.12-18.19Mb之间。
2、利用柑橘着丝粒组蛋白CenH3和染色质免疫共沉淀(ChIP)法定位柑橘着丝粒的物理位置。利用cDNA末端快速扩增技术克隆柑橘着丝粒CenH3(CsCenH3)基因，CDS长度为450bp，编码149个氨基酸，位于甜橙基因组5号染色体。以CsCenH3蛋白N-RQRRSEAGEGTPTAQRKR多肽制备柑橘特异anti-CsCenH3多克隆抗体，利用ChIP技术获得与CsCenH3结合的着丝粒DNA并测序。将ChIP-seq和Input-seq(不经免疫沉淀的DNA)样本的有效读长比对到参考基因组，比对率为87.16%和72.57%；进一步数据分析表明，每条染色体上CsCenH3富集区段至少有1个，且ChrUn有许多高度富集区段，表明有较多着丝粒序列并未完整组装于甜橙基因组；根据每条染色体CsCenH3富集区段排名前10的物理位置，将其分为2个或3个区域，估算每条染色体的着丝粒区域介于0.01-7.60Mb之间。‘Nadorcott’橘橙基因组重复序列分析表明272个聚类群共占基因组大小的49.20%，长末端重复序列逆转录转座子是其重要组成，其中gypsy、copia和caulimovirus类型分别占基因组大小的25.89%、15.69%和5.90%；进一步分析高度富集CenH3蛋白的6个着丝粒候选聚类群，表明长末端重复序列逆转录转座子也是其着丝粒重复序列的主要类型。
3、HTA法和ChIP法结合能有效定位柑橘着丝粒区域。在HTA法定位的着丝粒候选区域共获得完全匹配的串联重复序列676个，从中筛选重复单体大于10且重复序列总长度大于5kb的10条串联重复序列作为着丝粒候选探针序列；与CsCenH3高度结合(ChIP/Input大于10)的6个聚类群(CL34、CL246、CL14、CL108、CL149和CL205)共包含700个重叠群，其中富集度最高或重复序列总长度最长的18条重叠群被选作着丝粒候选探针序列；以上28条着丝粒候选探针序列重复单体长度介于209bp到5433bp之间，重复次数介于3.7到85.6次之间，总长度介于5.85kb到95.10kb之间。染色体原位杂交实验表明，以2条完全匹配的串联重复序列和7条与CsCenH3高度结合的着丝粒候选序列作为探针，在大部分染色体着丝粒处有杂交信号，表明两种方法结合能有效定位柑橘着丝粒区域。
4、利用新开发的亲本多态性SNP标记鉴定四倍体后代遗传来源和沃柑2n配子形成机制。以前人创制的36株四倍体后代(以沃柑为母本，3个异源四倍体(PCS、PO和SP)为父本倍性杂交)为研究材料，从亲本基因组测序筛选父母本均纯合的11,004个多态性SNP标记中，进一步筛选出亲本多态性标记9个，用于36株四倍体后代遗传鉴定；所有四倍体后代都聚在亲本基因型中间，表明它们均为杂种来源，是沃柑2n雌配子与父本二倍体花粉受精的产物。从亲本测序中筛选母本杂合且父本纯合的亲本多态性SNP标记80,079个，其中20,591个标记位于上述两种方法定位的柑橘着丝粒区域；进一步筛选出亲本多态性近着丝粒SNP标记8个和远离着丝粒SNP标记9个，用于沃柑2n雌配子形成机制鉴定；所有2n配子在17个SNP位点传递的杂合性介于5.88%-11.6%之间，表明在个体水平上，第二次减数分裂核复原可能是沃柑2n雌配子形成的机制；36个2n雌配子在8个近着丝粒SNP位点传递的杂合性都是0，且在9个远离着丝粒SNP位点传递的杂合性介于0-86.11%，表明在群体水平上，第二次减数分裂核复原可能是沃柑2n雌配子形成的机制。
综上所述，本研究利用半四分体和染色质免疫共沉淀法定位柑橘着丝粒物理位置；分析柑橘着丝粒重复序列特征，并发掘了9条着丝粒特异的染色体原位杂交探针序列；开发了近着丝粒SNP标记并用于柑橘2n雌配子形成机制鉴定。