猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒同属于冠状病毒,是引起猪腹泻和仔猪死亡的两种主要病原。本研究分别建立了普通双重RT-PCR和双重实时荧光定量RT-PCR鉴别诊断PEDV和TGEV的方法以及实时荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒的方法;同时构建了原核表达载体pET28a(+)-P-SP1,表达出了PEDV S蛋白,并对其免疫原性进行检测。主要研究内容如下:根据GenBank上发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计一条共用的下游引物和两条各自病毒基因的上游引物,可特异扩增出大小分别为213bp和546bp目的条带。特异性和敏感性检测结果显示所建立的检测方法具有很好的特异性以及较高的敏感性,为实验室诊断PEDV和TGEV提供了一种较为快速的手段。根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒N基因序列,设计了一对特异性引物和探针,扩增产物长度为186bp的片段。以克隆了N基因的质粒作为阳性标准品,利用ABI 7300荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪流行腹泻病毒含量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在101~108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的质粒DNA,以猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒为模板时,均检测不到荧光信号,而重复性实验中其变异系数均小于2%,从而表明此方法具有很好的特异性和重复性。根据TaqMan探针荧光定量分析原理,以FAM和JOE标记探针,设计两对引物和两条探针,通过对反应条件的优化,以T7体外转录得到的RNA为标准品,建立了一种TaqMan双重实时荧光定量RT-PCR(FQ-RT-PCR)检测PEDV和TGEV的方法。该方法具有良好的敏感性、重复性和特异性,能够检测到2×101拷贝/μL的病毒RNA,重复性试验中Ct值变异系数CV%均不超过2%,以猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒为模板进行FQ-RT-PCR时,均检测不到荧光信号。参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株S基因序列设计一对特异性引物,去除信号肽,以PEDV CH/ZJ株为模板,通过RT-PCR扩增出目的基因,克隆入原核表达载体pET28a(+),转化到Top10感受态细胞中,测序并分析,将重组质粒命名为pET-P-SP1。将pET-P-SP1转化到大肠杆菌E.coli BL21-DL3中,在IPTG诱导下表达;SDS-PAGE结果表明表达产物与预期大小相符,约36.7ku,重组蛋白以包涵体形式存在,薄层扫描结果表明表达产物占菌体蛋白的80%。Western blot分析表明表达蛋白能与抗PEDV高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫原活性。