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目的从人脂肪组织中提取培养脂肪组织来源干细胞(Adipose Tissue Derived Stromal Cells, ADSCs),了解其生物学特性；从人血管组织中分离提取血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF),并与含绿色荧光蛋白的双顺反子表达载体连接成重组质粒pSELECT-GFPzeo-VEGF,将其分别转染分离培养的不同代ADSCs,检测转染后的ADSCs对VEGF mRNA的表达、VEGF蛋白水平的变化以及成骨活性。方法胶原酶消化脂肪获取细胞后,接种于培养基中进行培养传代。通过流式细胞仪鉴定体外培养细胞的表面标志,观察其形态学特点,测定培养细胞的生长曲线。选取第2代ADSCs分别于条件培养基进行成脂、成骨及成软骨诱导分化,并分别采用油红"O"、Von Kossa染色、碱性磷酸酶染色及甲苯胺蓝进行染色。另外,采用Trizol法提取人血管组织总RNA,逆转录合成cDNA,通过巢式PCR从cDNA中扩增编码VEGF成熟肽的基因序列,将获得的目的基因VEGF与pGEM-T Easy线性载体进行连接,再将连接成功的质粒载体转化感受态大肠杆菌DH5α,经鉴定测序,进行回收。然后对重组克隆载体pTA2-VEGF和含绿色荧光蛋白的双顺反子表达载体pSELECT-GFPzeo-mcs进行酶切处理和连接以获得重组表质粒pSELECT-GFPzeo-VEGF,经再次鉴定测序,大量回收。最后经脂质体介导将重组表质粒pSELECT-GFPzeo-VEGF分别转染第2、3、4、5代ADSCs,并进行免疫荧光鉴定,经RT-PCR检测VEGF mRNA的表达水平。转染后分别于6h、12h、48h、72h回收转染组和空载体转染组ADSCs上清液,采用ELISA对VEGF的分泌进行定量检测,并进行统计学分析。另外,取第2代转染后的ADSCs设为VEGF基因转染组,另建两对照组分别为空载体转染组和空白细胞组,分别于成骨条件下进行培养,检测上清液中碱性磷酸酶、骨钙蛋白以及层粘连蛋白的分泌水平。结果胶原酶消化结合密度梯度离心及差速贴壁培养法分离出的细胞表面标记CD49d和CD44等呈现阳性表达,为具有干细胞特性的ADSCs。ADSCs于条件培养基培养后,经染色证实具有成脂、成骨及成软骨等多分化潜能。VEGF可以与含绿色荧光蛋白双顺反子表达载体成功构建为重组质粒pSELECT-GFP zeo-VEGF。荧光显微镜提示脂质体介导的VEGF目的基因片段能够成功转染至体外培养的ADSCs;经ELISA定量检测,上清液中VEGF mRNA表达水平在转染组显著增高,空载体转染组无明显变化,经统计学分析P<0.05,具有明显统计学差异。成骨条件培养下,VEGF转染后的ADSCs组对碱性磷酸酶、骨钙蛋白及层粘连蛋白的分泌量明显高于未转染组及空转染组(P<0.05),具有明显统计学差异。结论胶原酶消化结合密度梯度离心法及差速贴壁培养法可有效地从脂肪组织中获得具有定向诱导分化能力的ADSCs。经脂质体介导可成功将人VEGF目的基因片段转染至人ADSCs,并能够在体外持续有效的表达具有生物学活性的VEGF mRNA,分泌VEGF蛋白。在成骨条件培养下转染后的ADSCs能够大量分泌碱性磷酸酶、骨钙蛋白以及层粘连蛋白,其成骨能力明显增强。本试验可以将促血管治疗和干细胞移植有效结合起来,转染后的ADSCs可以有效促进成骨及成血管化,并可以更好的粘附于支架材料,用以修饰构建组织工程骨与软骨进行体内修复,从而对骨折不愈合、延迟愈合或骨缺损等的治疗奠定了试验基础。