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目的:盐酸埃克替尼(icotinib)为我国常用且有效的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)。由于其靶向性和低毒副作用的特点,在临床上EGFR突变的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的治疗中取得了显著的疗效。但大多数病人在用药9～15个月后会产生获得性耐药,这已成为临床中亟需解决的问题。很多研究表明EGFR-TKI耐药与基因的变异有关,主要包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)和拷贝数变化(copy number variation,CNV)。与进口的EGFR-TKI吉非替尼和厄洛替尼相比,icotinib的分子结构和体内代谢途径不同,因此icotinib的耐药可能存在不同的耐药机制。本研究利用全外显子测序技术对亲本和icotinib耐药细胞基因组进行测序,寻找icotinib耐药相关的基因组变异,并对其耐药机制进行初步研究。方法:首先,我们选用具有EGFR-TKI敏感突变的NSCLC细胞株PC-9(EGFR 19外显子E746-A750缺失),在体外采用icotinib浓度梯度递增法诱导建立耐药细胞株PC-9/icotinib resistance(IR)。通过形态学观察、MTT实验、划痕实验、蛋白印迹(Western blot,WB)和免疫荧光对耐药细胞PC-9/IR进行鉴定。然后提取PC-9和PC-9/IR细胞基因组DNA进行全外显子测序,分析测序结果,找到差异的SNV,indel和CNV,并在DNA、mRNA、蛋白和细胞生物学水平对icotinib耐药相关的SNP和CNV进行验证。最后,为了验证得到的耐药相关CNV(钙蛋白酶7扩增)是否为icotinib耐药特异性的变化,我们选取了两株EGFR-TKI耐药细胞,A549(EGFR野生型,对EGFR-TKI原发性耐药)和H1975(具有EGFR-TKI继发性耐药突变EGFR T790M和敏感突变21外显子L858R),在体外大剂量icotinib进行诱导40周,在DNA、mRNA和蛋白水平对钙蛋白酶7(calpain-7,CAPN7)在诱导前后的细胞模型中进行验证,探讨icotinib的耐药机制。结果:经过40周的icotinib诱导得到耐药的NSCLC细胞PC-9/IR,与亲本细胞相比,耐药细胞PC-9/IR的形态由圆形变为梭形,在同一药物浓度下耐药细胞的细胞活力高与亲本,且PC-9/IR细胞的迁移速率,靶点蛋白磷酸化的EGFR表达水平明显高于亲本PC-9细胞。免疫荧光实验检测耐药细胞中钙黏蛋白和波形蛋白的表达水平,提示PC-9/IR并没有发生上皮间质转化。利用全外显子测序,我们分别在PC-9和PC-9/IR细胞中鉴定出76,475和79,150个 SNPs,10,228 和 10,891 个插入缺失变化(insertions and deletions,indels)。与PC-9比较我们得出了 PC-9/IR细胞中有差异的183个单核苷酸变异(single nucleotide variations,SNV)和10个indels。此外,我们还发现PC-9/IR细胞中出现的3个CNV的变化:CAPN7的扩增,胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2(Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2,IGF2BP2)和 KIAA0922(也称为 transmembrane protein 131-like,TMEM131L)的缺失。我们在DNA、mRNA、蛋白和细胞学不同水平对测序结果进行了验证,结果证实PC-9/IR细胞中存在T790M和RAS/Raf信号通路激活,使用针对T790M的三代EGFR-TKIAZD9291,以及RAS/Raf通路抑制剂U0126可以抑制耐药细胞的增殖。Real time PCR和WB实验结果表明PC-9/IR细胞中CAPN7在基因组DNA水平拷贝数出现扩增,在mRNA和蛋白水平的表达均高于亲本细胞。我们对EGFR-TKI耐药细胞A549和H1975细胞用大剂量icotinib进行了诱导,得到了耐药性更强的A549/IR和H1975/IR细胞。与诱导前相比,两者CAPN7在DNA水平拷贝数均出现扩增,提示CAPN7的扩增可能为icotinib特异性作用的结果。在mRNA和蛋白水平,H1975/IR细胞中CAPN7的表达高于诱导前细胞,在EGFR野生型的A549/IR细胞中CAPN7的表达与诱导前相比无显著性差异。结论:本研究成功建立了 icotinib耐药的NSCLC细胞PC-9/IR。利用全外显子测序技术分析PC-9/IR和PC-9细胞的基因组变异,通过生物信息学分析发现了icotinib耐药相关的183个SNVs,10个indels和3个CNVs,其中共有57个可能引起基因功能的变化。其中在PC-9/IR、A549/IR和H1975/IR细胞中,CAPN7在基因组DNA水平扩增;在PC-9/IR和H1975/IR细胞中,CAPN7在mRNA和蛋白水平的表达均高于诱导前细胞。以上结果提示我们CAPN7的扩增和表达增加与icotinib耐药相关,并且可能是icotinib特异性诱导的结果。