论文部分内容阅读
第一部分:褪黑素(melatonin,MT)是一种小分子的神经-内分泌激素,分泌于脊椎动物松果体中,后来发现普遍存在在植物、动物等生物体内。褪黑素可以调节脊椎动物生物节律和光周期反应,改善睡眠障碍,增强免疫等;可以促进植物生根及提高植物抗氧化能力等。相比而言,植物中褪黑素的代谢类似于动物途径,由色氨酸合成前体,经过色氨酸羟化酶(T5H)、色氨酸脱羧酶(TDC)、5-羟色胺-N-乙酰转移酶(AANAT)、羟基吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)催化,形成褪黑素来完成一系列功能,其功能研究刚刚开始。对植物褪黑激素合成关键的酶研究有助于了解植物褪黑激素的作用机制、动态累积及其功能。基于此,本研究采用比较基因组学的方法,分析比较不同植物物种中TDC、T5H、AANAT、HIOMT的生物信息学数据,为褪黑素合成关键酶的研究提供参考,为后期植物中褪黑激素的代谢、功能的深入研究鉴定基础。所取得的主要结果有:(1)除薯蓣种TDC蛋白的分子量较小外,不同植物的TDC蛋白的分子量分布在55000Da-58000Da之间,理论等电点在5.35-6.65之间;除大麦的TDC1、TDC2蛋白以及薯蓣的TDC2蛋白以外,其余的TDC蛋白均为不稳定蛋白;样本中TDC蛋白呈现亲水性,有两个明显的疏水区域;除长春花、萝芙木、蛇根草以及水稻以外,其他样本中TDC蛋白转运肽存在于细胞质中;TDC蛋白蛋白的进化树呈现3个分支。(2)除桑树T5H1蛋白的分子量较小之外,不同植物的T5H蛋白的分子量分布在50000Da-57000Da之间,理论等电点在8.80-9.10之间;除桑树T5H1及T5H2蛋白外,其余T5H蛋白均为不稳定蛋白;样本中T5H蛋白都呈现亲水性,有两个明显的疏水区域;紫衫T5H 1-T5H 5号蛋白中,叶绿体转运肽信号几乎不存在,线粒体转运肽的分值较高,而桑树的三种T5H蛋白的分泌途径信号肽和其他分值较高;T5H蛋白的进化树呈现3个分支。(3)对比莱茵衣藻的AANAT与HIOMT蛋白,AANAT蛋白的氨基酸残基数、分子量与等电点均小于HIOMT蛋白;AANAT蛋白为稳定蛋白,而HIOMT蛋白为不稳定蛋白;AANAT蛋白的整个多肽链是呈亲水性的,有两个很明显的疏水区域;HIOMT蛋白的整个多肽链是呈疏水性的,整个多肽链上有三个明显的亲水区域。第二部分:贻贝粘合蛋白(Mussel Adhesive Protein,MAP),亦称贻贝足丝蛋白(Mytilus foot p roteins,Mfps)是海洋软体动物贻贝(Mytilus)足丝腺分泌的蛋白质复合物。Mfps耐腐蚀,在湿性环境有强粘性,医学中使用无毒、无免疫原性,生物相容性好。天然的贻贝粘合蛋白,提取时易固化且含量低,难以获得。目前利用基因工程技术,在原核表达(大肠杆菌)及真核表达(酵母、烟草)系统中重组贻贝粘合蛋白研究其性质及功能。前期在烟草中表达了地中海贻贝蛋白(Mytilusgalloprovincia均isfoot protein type 5,Mgfp-5)基因,得到转mgfp-5基因烟草。植物组织培养具有细胞增殖快、培养周期短、材料均一、重复性好、不受季节与环境限制等优点,在烟草组织和细胞培养、基因转化和次生物质生产等已有不少成功报道,然而未见到借助烟草组织研究重组蛋白Mgfp-5的报道。基于此,实验借助前期转贻贝基因mgfp-5的T1代烟草作为外植体,诱导、培养得到重组蛋白Mgfp-5可以稳定表达愈伤组织,拓宽重组蛋白Mgfp-5的植物材料来源,为重组贻贝粘蛋白的研究提供参考。研究的主要结果如下:(1)转贻贝基因mgfp-5的烟草愈伤组织诱导:20 mg/L卡那霉素(Kan),抗性萌发转基因T1代种子无菌苗进行愈伤组织诱导,在附加不同浓度的2,4-D、6-BA、NA A 的 MS 培养基上,诱导率≥90.0%;MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L+20 mg/Lkan时诱导率为100%。(2)愈伤组织的固/液培养:用 MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L+20 mg/Lkan培养基,固/液培养愈伤组织,愈伤组织均呈现“S”型曲线生长;固体培养时12-27d鲜质量增长率为3.73,液体培养时间缩短6d,在6-15d时间内鲜质量会增加8.56-8.63 倍。(3)重组蛋白Mgfp-5的稳定表达鉴定:固/液培养的继代的烟草愈伤组织中,PCR、RT-PCR扩增到预期600 bp与260 bp条带,Western blot检测到预期(9.8kD)的蛋白,显示了在继代培养的转基因烟草愈伤组织,外源mgfp-5基因及Mgfp-5蛋白可以稳定表达。