1.目的：食管鳞癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一,缺乏敏感、特异的早期诊断和生物防治的指标和方法,以及侵袭和转移是食管鳞癌发病率和死亡率居高不下的主要原因。在分子水平上探索ESCC侵袭转移相关基因,寻找敏感、特异的预后指标,具有重要的理论意义和临床应用价值。功能性研究显示miRNA起到抑癌和致癌的作用,提示miRNA可能成为新型诊断和治疗的靶点。血液miRNA用于一些肿瘤的早期诊断。miR-31参与了多种肿瘤的转移过程。乳腺癌的研究证实：miR-31并非影响原发灶而是通过抑制局部侵袭、外渗或初始定植和转移性克隆形成等关键个步骤而抑制转移,并且过表达miR-31可多效性地抑制乳腺癌细胞转移。据此我们的假说是：miR-31可能与食管鳞癌的转移有关,研究miR-31与食管鳞癌的关系有助于揭示食管鳞癌侵袭转移机制。2.资料与方法：2.1细胞培养人食管鳞癌细胞系EC9706、KYSE150和KYSE510保存在Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)中期培养液,10%新生牛血清和37℃、5%CO2浓度下,于恒湿培养箱(Model 3121,SeriesⅡwater jacketed CO2 incubator, HEPA filter, Thermo Forma, USA)培养。2.2.miRNA转染miR-31 (i.e.miR-31 mimics)及其抑制物(anti-miR-31)的SiRNA duplexes同源序列由Shanghai Gene-Pharma Co.(Shanghai, China)合成纯化。不含特异序列的SiRNA duplexes作为阴性对照(NC)。miR-31 mimics及其抑制物anti-miR-31和NC的duplexes通过Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen Corp. CA, USA)转染进EC9706、KYSE150和KYSE510细胞系：培养的细胞以5×104/孔的密度转染前1天接种在24孔板,然后将miR-31 (i.e.miR-31 mimics)及其抑制物(anti-miR-31)的SiRNA duplexes同源序列以150nM/孔的密度转染细胞。2.3Transwell细胞迁移实验细胞迁移实验由TranswellR可渗透支持系统完成(Corining, Inc. Corining, NY)。转染24h后,将2×104细胞导入到无血清的DMEM培养基,然后加到6.5mm直径的Transwell小室(8μm孔径),下层用含600μL的10%含血清的DMEM培养基。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养24h以研究细胞的迁移能力。用棉签去除膜上表面非迁移的细胞,同样下表面细胞经用采用0.4%结晶紫染色,染色后可以用33%醋酸脱色,使用Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照。取10个随机视野计数细胞个数。2.4细胞侵袭实验实验步骤基本同迁移实验,不同之处在于培养小室聚碳酸酯膜上包被Matrigel(5μg/ml)形成一连续薄层,称为“人工基底膜”。此层人工基底膜在接种细胞前必须用无血清培养液室温湿润2h。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养24h以研究细胞的侵袭能力。用棉签去除膜上表面非侵袭的细胞,同样下表面细胞采用0.4%结晶紫染色,染色后可以用33%醋酸脱色,使用Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照。取固定的位置10个随机视野计数细胞个数。2.5细胞-基质黏附实验将转染24h后的细胞导入到预先涂上Matrigel(5μg/孔)的96孔板,分别在选择在孵育0min、30min、60min、90min、120min检测MTS(黏附率)。孵育后以PBS洗去没有黏附的细胞,黏附上的细胞固定、染色、计数。2.6研究对象来自于2008.3—2010.3在河南省肿瘤医院病理诊断为原发性食管鳞癌的患者和河南省人民医院体检的无症状人群。无症状人群组随机选取男女健康体检者共121例,男性76例,女性45例,年龄范围31-78岁,中位年龄50岁,；清晨7时空腹采取上肢静脉血。120例原发性食管鳞癌患者,男性79例,女性41例,年龄范围38-75岁,中位年龄54岁,其中Ⅰ期(n=28)、Ⅱ期(n=31)、Ⅲ期(n=33)和Ⅳ期(n=28),如行手术治疗则于手术当日和术后7天清晨7时空腹采取上肢静脉血。所有的患者在手术和采血前均未接受放化疗。2.7组织和血液处理标本离体后,立即将标本沿中线纵行切开、展平,一半用?=85%酒精固定,做常规病理诊断；另一半立即投入液氮保存,转运到实验室后,再放入-80℃冰箱中。取直径约icm癌组织及距切缘5cm的正常组织约0.5cm行miRNA检测。抽取全血8ml,收集在含有EDTA的试管中,标号,1,200×g 4℃离心10分钟以去除血细胞,收集上清在微量离心管中,然后二次以1,200×g 4℃离心10分钟以彻底去除血细胞,血浆然后分成若干管放置在-80℃冰箱待用。2.8 RNA抽提食管鳞癌组织或正常组织或细胞或血浆采用miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取总RNA,方法参照说明书。以分光光度计测定RNA纯度和浓度,OD260/280范围在1.7-2.1,符合测定要求。RNA浓度：组织和细胞在310-590 ng/μL,血浆在20-100 ng/μL。2.9 Real-time PCR检测miR-31表达2.9.1总RNA加尾：采用poly A polymerase(PAP, NEB, USA)对全部RNA添加poly A尾；取500 ng的血浆或组织RNA,按1ug RNA加20u酶,1mM ATP,反应体积10 ul,37℃水浴20分钟2.9.2反转录成cDNA以5-’GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTCG-3’为引物,采用PrimeScriptTM RT kit (TaKaRa)根据说明书的用法将加尾后的总RNA反转为cDNA,反应条件：37℃15 min(反转录反应),85℃5 sec(反转录酶的失活反应),-20℃冰箱冻存。3. Real-time PCR检测mircroRNA表达采用5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’作为通用引物,RNU6B引物序列为5’-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3’; has-miR-16引物序列为5’-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3’; has-miR-31引物序列为5’-AGGCAAGATGCTGGCATAGCT-3’;组织内参基因采用RNU6B,血液内参基因采用has-miR-16;所有序列由Invitrogen Crop合成,应用SYBRR Premix Ex TaqTM PCR kit试剂盒在ABI PRISM 7300 Real-time PCR system (AppliedBiosystems)完成。两步法PCR程序：Stage 1:预变性95℃,31秒20℃/秒,1 Cycle; Stage 2:PCR反应95℃,5秒20℃/秒,60℃20秒20℃/秒,40 Cycles;Stage 3:融解曲线分析,95℃0秒20℃/秒,65℃15秒20℃/秒,95℃0秒0.1℃/秒。在PCR循环结束时绘制溶解曲线,并行产物3.5%的琼脂糖凝胶电泳以验证是否有预期产物扩增。每份样品设3个副管。癌组织与癌旁正常组织miR-31的CT值比率采用相对CT法(2-⊿CT),⊿CT=CT癌-CT正常。组织和细胞系的miR-31表达水平(CT值)用内参RNU6B标准化。因为组织中常用的内参RNU6B和5S rRNA在血浆中降解,并且没有公认的用于实时定量PCR分析的看家基因,我们采用文献报道的miR-16作为血浆miR-31表达水平分析的内参,血浆miR-31表达用miR-16标准化。2.10统计学处理：采用SPSS 16.0软件对数据进行分析,均以P<0.05表示差异有显著性意义。荧光定量PCR采用非参数秩和检验或单因素方差分析(One-way ANOVA)。生存时间分析采用Kaplan-Meier法。血浆miR-31的表达对食管鳞癌诊断的预测作用以ROC曲线表示。3结果3.1 miR-31与食管鳞癌细胞的侵袭和转移1)三种食管鳞癌细胞系miR-31的表达与转移能力的关系人食管鳞癌细胞系EC9706、KYSE150、KYSE510的miR-31分别为0.025、0.004和0.001(标准化后的相对水平),转移能力强的EC9706和KYSE150表达水平高于转移能力弱的KYSE510。2)miR-31过表达和抑制对三种食管鳞癌细胞系体外迁移、侵袭和黏附能力的影响TransWell细胞迁移实验、细胞侵袭实验表明转染miR-31后的细胞迁移、侵袭较对照组增强,透过基底膜的细胞数均增加了2倍以上,细胞-基质黏附实验表明转染miR-31后黏附能力也明显增强；抑制后(anti-miR-31)的细胞迁移、侵袭和黏附能力低于对照组。3.2 miR-31在食管鳞癌组织的表达1)食管鳞癌组织和癌旁正常组织的miR-31表达检测的45对样品中,有34对样品在食管癌组织中上调高表达,占75.5%。食管鳞癌组织(n=45)的miR-31显著高于配对的癌旁正常组织(n=45)(P=0.0441)。2)食管鳞癌组织的miR-31表达与淋巴结转移的关系转移组(21例)的miR-31显著高于未转移组(24例)(P=0.0243)3)食管鳞癌组织的miR-31表达与TNM分期的关系食管鳞癌组织的miR-31表达在各TNM分期之间有显著差异(P=0.0496),其中Ⅰ期(n=7)与Ⅲ期(n=21)之间有显著差异(P=0.0361)、Ⅱ期与Ⅲ期(n=14)无显著差异(P=0.0832)。3.3食管鳞癌患者血浆miR-31的表达1)食管鳞癌患者与无症状人群的血浆miR-31表达食管鳞癌患者(n=120)的血浆miR-31表达显著高于无症状人群(n=121)(P<0.0001)2)食管鳞癌患者血浆miR-31表达与淋巴结转移的关系有转移组(n=65)的血浆miR-31表达显著高于无转移组(n=55)(P<0.00013)食管鳞癌患者血浆miR-31表达与TNM分期的关系食管鳞癌患者血浆miR-31随TNM分期提高而增高,其中Ⅳ期(n=28)显著高于Ⅰ期(n=28)、Ⅱ期(n=31)和Ⅲ期(n=33),P分别为<0.0001、0.0002、0.0263,但Ⅰ期和Ⅱ期之间,Ⅱ期和Ⅲ期之间,Ⅰ和Ⅲ期之间,无显著差异(P>0.05)。4)术前术后食管鳞癌患者血浆miR-31的表达变化食管鳞癌患者术前血浆miR-31显著高于术后(P<0.0001)5)术后食管鳞癌患者血浆miR-31的表达与生存的关系以内参miR-16表达为标准,术后食管鳞癌患者血浆miR-31表达高于自身miR-16者为高表达组,低者为低表达组。miR-31低表达组2年生存率为80%(16/20),显著高于高表达组的50%(12/24),低表达组生存时间显著长于高表达组(P=0.034)；miR-31低表达组2年无复发生存率为60%(12/20),显著高于高表达组的42%(10/24)(P=0.0234)。6)血浆miR-31对食管鳞癌诊断的预测价值以血浆中的CT miR-31-CT miR16≤7.4作为诊断食管鳞癌的标准,血浆miR-31对食管鳞癌诊断的灵敏度和特异度分别为86.7%和84.3%。4.结论4.1 miR-31促进食管鳞癌的侵袭和转移,并可能是新的治疗靶点1)miR-31通过促进食管鳞癌的细胞迁移、细胞侵袭、细胞基质黏附等过程促进侵袭和转移,可能是食管鳞癌候选的癌基因。2)体外试验证实通过反义阻断使miR-31功能的正常化从而达到抑制食管鳞癌细胞转移理论上是可行的。4.2 miR-31可作为食管鳞癌的潜在标志物血浆miR-31对食管鳞癌诊断的灵敏度和特异度高,并且取材简便、无创。可能是食管鳞癌早期诊断、判断预后、预测复发和转移的潜在标志物。4.3生物信息学预测结合文献,我们预测miR-31在食管鳞癌的候选靶基因是：MAPK1, MAPK4, PDE4D和RASA1,值得深入研究。