研究目的:皮肤创伤是临床常见疾病,各种原因导致的创面不愈或病理性瘢痕,严重影响患者的身心健康。毛囊干细胞（Hair Follicle Stem Cells,HFSCs）是一种多能干细胞,在创伤时可分化成表皮和毛囊、皮脂腺、汗腺等皮肤附属器,参与皮肤创面修复。伤科要药血竭具有活血化瘀、收敛止血、生肌敛疮、软坚散结和消肿止痛等功效。龙血素A作为血竭的主要活性成分能有效诱导HFSCs向表皮分化,但其作用机制尚未研究清楚。Micro RNAs（miRNAs）是近年来的研究热点,越来越多的研究表明miRNAs调控细胞分化、生物发育及疾病发生、发展过程。首先,本研究在体外探索了龙血素A对HFSCs miRNA表达谱的影响;明确了miR-339-5p与DLX5的靶向调控关系,并探讨了miR-339-5p/DLX5对HFSCs分化以及经典Wnt信号通路的影响;然后,本研究在体内通过构建大鼠触须部皮肤缺损模型,探究了miR-339-5p单独或者与龙血素A联用对皮肤创面修复的影响。研究方法:1.取1～3 d SD乳鼠触须部毛囊,利用“两步酶”消化法获得HFSCs。免疫荧光双染法检测所得HFSCs中细胞表面标记物CD34与K15的表达。2.收集空白对照组和龙血素A处理组HFSCs各3例,通过miRNA微阵列芯片筛选两组差异表达的miRNAs。选取差异表达明显的miRNAs进行实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）验证。3.分别转染miR-339-5p的mimic和inhibitor至HFSCs,采用Western Blot、免疫荧光检测DLX5蛋白的表达水平;通过构建靶基因DLX5的双荧光素酶报告基因来检测荧光素酶的活性。4.分别转染miR-339-5p的mimic和inhibitor或DLX5的小干扰RNA（small interfering RNA,si DLX5）至HFSCs,采用Western Blot检测HFSCs分化相关蛋白（Involucrin、K10）以及经典Wnt信号通路中Wnt3a蛋白的表达水平。5.选用200～220 g SD雄性大鼠,制作SD大鼠触须部皮肤创伤模型后,按随机原则分为空白对照组、阴性对照组、实验组。单独处理类分别皮下注射生理盐水、agomir NC、miR-339-5p agomir、antagomir NC、miR-339-5p antagomir;联合处理类在上述基础上联合DMSO或龙血素A外用,于术后3 d和6 d对各组创面进行创面愈合情况评分、HE染色和Masson染色检测各组创面修复情况。研究结果:1.“两步酶”法分离、培养的细胞为圆形或多角形,典型铺路石状,呈CD34、K15表达阳性。2.miRNA微阵列芯片共筛选出92个差异表达miRNAs,其中龙血素A组显著上调41个miRNAs,下调51个miRNAs。RT-q PCR结果显示,miR-339-5p的表达在龙血素A处理组显著减少,与芯片结果趋势一致。3.Western Blot和免疫荧光结果显示,与相应的NC组比较,miR-339-5p mimic转染组中的DLX5表达降低,而miR-339 inhibitor转染组中的DLX5表达增加。双荧光素酶报告基因结果显示,miR-339-5p mimic使p LUC-DLX5的荧光素酶活性降低,而miR-339-5p inhibitor使p LUC-DLX5的荧光素酶活性增高。4.Western Blot结果显示miR-339-5p mimic能抑制Involucrin、K10及Wnt3a的蛋白表达;miR-339-5p inhibitor能促进Involucrin、K10及Wnt3a的蛋白表达。5.miR-339-5p antagomir促进大鼠触须部创面表皮重建、血管再生以及胶原纤维的分泌。miR-339-5p antagomir与龙血素A联用时,上述结果更为明显。研究结论:1.龙血素A下调HFSCs中miR-339-5p的表达。2.DLX5是miR-339-5p潜在的靶基因。3.miR-339-5p/DLX5通过经典Wnt信号通路影响HFSCs的分化能力。4.龙血素A联合miR-339-5p antagomir促进皮肤创面修复。